噬菌体展示技术筛选与褐飞虱中肠刷状缘膜囊泡结合短肽

论文摘要

解剖1000头褐飞虱5龄若虫,获取中肠部位,研磨后梯度离心得到刷状缘膜囊泡BBMV,运用噬菌体展示技术筛选与BBMV特异结合的短肽,通过PCR扩增连接短肽序列和绿色荧光蛋白GFP序列,将重组序列先后连接到克隆载体pMD18-T和表达载体pET-32a,并分别转化大肠杆菌JM109和BL21,最后用IPTG诱导表达重组序列,得到大小约45KDa的融合蛋白,利用表达载体pET-32a的组氨酸标签提纯融合蛋白。通过膜饲喂方法以融合蛋白喂食褐飞虱5龄若虫,解剖得到中肠,将中肠在PBS溶液中清洗后转移至荧光显微镜下用蓝紫光观察,结果显示融合蛋白可以结合到褐飞虱的中肠。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 苏云金芽胞杆菌
• 1.1.1 苏云金芽胞杆菌概述
• 1.1.2 Cry 蛋白的杀虫机制
• 1.2 噬菌体展示技术
• 1.2.1 噬菌体展示技术概述
• 1.2.2 噬菌体展示技术的应用
• 1.3 绿色荧光蛋白
• 1.3.1 绿色荧光蛋白概述
• 1.3.2 绿色荧光蛋白的应用
• 1.4 稻飞虱的危害与主要防治措施
• 1.5 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试昆虫
• 2.1.2 菌株与载体
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 试剂盒与反应体系
• 2.1.5 其他试剂和材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 提取刷状缘膜囊泡BBMV
• 2.2.1.1 梯度离心中肠匀浆液
• 2.2.1.2 碱性磷酸酶活性测定
• 2.2.1.3 蛋白浓度测定
• 2.2.2 噬菌体肽库淘选实验
• 2.2.2.1 噬菌体滴度测定
• 2.2.2.2 淘选程序
• 2.2.2.3 提取单克隆噬菌体DNA
• 2.2.2.4 噬菌体DNA 测序
• 2.2.3 构建克隆载体
• 2.2.3.1 设计引物
• 2.2.3.2 PCR 反应
• 2.2.3.3 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.3.4 PCR 产物回收
• 2.2.3.5 连接克隆载体
• 2.2.3.6 转化JM109
• 2.2.3.7 提取重组质粒
• 2.2.3.8 单双酶切验证
• 2.2.3.9 测序验证
• 2.2.4 构建表达载体
• 2.2.4.1 双酶切重组质粒
• 2.2.4.2 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.4.3 切胶回收
• 2.2.4.4 连接表达载体
• 2.2.4.5 转化BL21
• 2.2.4.6 提取重组质粒
• 2.2.4.7 单双酶切验证
• 2.2.5 诱导表达
• 2.2.6 蛋白提纯
• 2.2.7 SDS-PAGE 验证
• 2.2.8 膜饲法观察结合情况
• 3 结果和分析
• 3.1 BBMV 提取结果
• 3.2 噬菌体肽库淘选结果
• 3.3 克隆结果
• 3.3.1 PCR 反应结果
• 3.3.2 单双酶切验证结果
• 3.4 融合蛋白诱导和提纯结果
• 3.5 融合蛋白与中肠结合情况
• 4 讨论
• 参考文献
• 致谢