基于COⅠ、12S rDNA和ITS-2基因序列的犬恶丝虫分子系统发生研究

基于COⅠ、12S rDNA和ITS-2基因序列的犬恶丝虫分子系统发生研究

论文摘要

犬恶丝虫(Dirofiliaria immitis)又名心丝虫(heartworm),为丝虫的一种,在传统形态学分类中被划分于丝虫总科,盘尾丝虫科,恶丝虫属。犬恶丝虫病为人兽共患寄生虫病,呈世界性分布,严重影响多种犬科和猫科动物以及部分野生肉食动物的健康,给社会经济、生态环境带来巨大损失和危害。寄生虫的系统发生研究是寄生虫病防治的理论基础,进行犬恶丝虫的系统发生研究对于全面认识犬恶丝虫及犬恶丝虫病的防治具有重要意义。论文以线粒体基因细胞色素氧化酶亚单位Ⅰ(cytochrome coxidase subunitⅠ,COI)和小亚单位核糖体核糖核酸(small subunit ribosomal RNA,12S rDNA)及核糖体基因内部转录区2(internal transcribed spacer 2,ITS-2)为靶序列,通过对相关序列进行分析,运用不同的进化树构建方法,包括最小进化法、邻接法和最大似然法,从距离距阵和遗传性状两个方面构建系统树,对小熊猫恶丝虫(重庆株、成都株)和犬恶丝虫(雅安株)的分子分类及两者与其它相关丝虫的种系发生关系进行研究。通过分析不同虫种COI、12S rDNA和ITS-2基因序列间的差异和构建系统进化树,结果显示,不同虫种COI基因序列的同源性高于82.8%,小熊猫恶丝虫和犬恶丝虫之间的序列同源性超过了99.8%;各序列间的趋异值在0~19.6之间,小熊猫恶丝虫和犬恶丝虫之间的序列趋异值小于0.2。不同虫种12S rDNA基因序列的同源性高于78.0%,小熊猫恶丝虫和犬恶丝虫之间的序列同源性超过了98.4%;各序列间的趋异值在0.2~26.1之间,小熊猫恶丝虫和犬恶丝虫之间的序列趋异值小于1.6。不同虫种ITS-2基因序列的同源性高于71.20%,小熊猫恶丝虫和犬恶丝虫之间的序列同源性超过了98.5%;各序列间的趋异值在0.4~36.3之间,小熊猫恶丝虫和犬恶丝虫之间的序列趋异值小于1.6。序列分析的结果表明小熊猫恶丝虫和犬恶丝虫具有高度的同源性,应为同一虫种,小熊猫恶丝虫为犬恶丝虫的同种异名。在系统进化树中,包括基于COI基因构建的ME树和MP树,基于12S rDNA基因构建的ME树和MP树以及基于ITS-2基因构建的NJ树和MP树,小熊猫恶丝虫和犬恶丝虫均被聚合到一起,形成一个深的分支树,其置信值高于99%;盘尾丝虫科聚合成为3个大的分支树,即盘尾丝虫属,恶丝虫属及布鲁丝虫属+吴策丝虫属。这一结果表明基于形态学和分子生物学特征的盘尾丝虫超科分类结果存在一定差异,从一定程度上来说,应对盘尾丝虫超科的虫种分类结果进行部分的修订。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 1 文献综述
  • 1.1 分子系统发生学概述
  • 1.1.1 概念及发展简史
  • 1.1.2 分子系统发生学的常用方法
  • 1.1.3 分子系统发生学的优点
  • 1.2 分子系统发生学与寄生虫学
  • 1.2.1 分子系统发生学在寄生虫学上的应用
  • 1.2.2 寄生虫分子系统的分析常用靶序列
  • 1.3 犬恶丝虫概述
  • 1.3.1 形态特征
  • 1.3.2 地理分布
  • 1.3.3 宿主
  • 1.3.4 发育生物学
  • 1.3.5 系统发生研究现状
  • 1.4 实验目的和意义
  • 2 材料与方法
  • 2.1 实验材料
  • 2.1.1 样品来源
  • 2.1.2 主要试剂的配制
  • 2.1.3 PCR相关试剂
  • 2.1.4 其它实验室常规试剂
  • 2.1.5 主要实验仪器
  • 2.2 实验方法
  • 2.2.1 犬恶丝虫的采集
  • 2.2.2 犬恶丝虫 DNA的提取
  • 2.2.3 模板DNA的质量检测与浓度确定
  • 2.2.4 实验引物的设计
  • 2.3 PCR扩增
  • 2.3.1 引物的稀释
  • 2.3.2 PCR反应条件及优化
  • 2.3.3 PCR产物的检测
  • 2.3.4 PCR扩增产物的回收
  • 2.4 目的基因的克隆
  • 2.4.1 连接
  • 2.4.2 克隆载体的转化、筛选与鉴定
  • 2.5 阳性克隆菌的测序
  • 2.6 序列分析
  • 2.6.1 序列的比对
  • 2.6.2 相关序列的下载
  • 2.6.3 序列间距离分析
  • 2.6.4 进化树构建
  • 3 结果
  • 3.1 模板DNA的质量检测与浓度确定
  • 3.2 PCR扩增
  • 3.2.1 最佳 PCR反应体系
  • 3.2.2 PCR扩增产物
  • 3.3 目的基因的克隆及鉴定
  • 3.4 阳性克隆菌的测序和序列分析
  • 3.4.1 阳性克隆菌的测序
  • 3.4.2 序列分析
  • 4 讨论
  • 5 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读硕士学位期间发表论文
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