猪瘟病毒E2蛋白在昆虫细胞中的表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

论文摘要

猪瘟（Classical Swine Fever,CSF）是由猪瘟病毒引起的一种高度接触性热性传染病,猪是其唯一的自然宿主。病毒可通过胎盘传染,造成胎儿死亡和先天性感染猪迟发病和死亡。发病率、致死率高,在猪业造成严重损失。因此,猪瘟病毒的检测技术历来为国际畜牧兽医界所重视。CSFV的诊断方法很多,其中,血清学抗体检测应用较多。ELISA方法特异性好,灵敏度高,使用广泛。在CSFV的结构蛋白中,E2囊膜糖蛋白是CSFV主要保护性抗原蛋白,能诱导机体产生中和抗体。所以,它既是人们研究CSFV新型疫苗的主要对象,也是建立CSFV血清学检测方法的首选抗原。本研究目的是将E2蛋白N端包含主要抗原区的一段序列（E2-1）（含N端高保守序列）克隆入杆状病毒表达载体系统中,转染昆虫细胞,获得体外表达的E2-1蛋白,并将该蛋白作为包被抗原建立间接ELISA抗体检测方法。主要内容包括:1.杆状病毒表达CSFV E2-1:用RT-PCR技术从国内分离的CSFV疫苗株中获得大小为537bp的PCR产物,将其克隆至pFastBacTMHT A转移载体,转化DH5α,然后在LB平板上挑取阳性菌落,得到的重组转移质粒pFastBacTMHT A-E2-1,再提取阳性克隆质粒转化到含杆状病毒穿梭载体Bacmid的受体菌E.coliDH10Bac中,发生转座作用,在舍庆大霉素,卡那霉素,四环素3种抗生素和X-gal/IPTG的LB培养板上,筛选出白色菌落得到重组穿梭载体Bacmid-E2经PCR鉴定为阳性后,采用阳离子脂质体法转染到Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒,经IFA、SDS-PAGE和Western-blotting鉴定,结果表明,E2-1蛋白在Sf9昆虫细胞中成功表达。2.间接ELISA抗体检测方法的建立:在上述工作的基础上,以重组杆状病毒E2-1蛋白为包被抗原,经条件优化,建立了监测CSFV血清抗体水平的间接ELISA方法,并用以重组杆状病毒E2-1蛋白建立的ELISA法和猪瘟IDEXX抗体检测ELISA试剂盒同时检测92份猪血清,检测结果显示符合率达到83.7%,并用该方法检测了135份临床血清样品。本试验成功表达了重组杆状病毒E2-1蛋白（约22kDa）;建立的间接ELISA诊断方法具有良好的特异性和敏感性,为免疫猪群抗体监测和CSF流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学检测方法。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 文献综述 猪瘟病毒分子生物学研究进展
• 1 猪瘟病毒的生物学特性及其研究进展
• 1.1 病毒粒子结构
• 1.2 CSFV的抗原性、毒力和分型
• 1.3 CSFV基因组结构
• 1.4 CSFV的主要结构蛋白及其功能
• 1.5 CSFV非结构蛋白的结构与功能
• 1.6 CSFV全长感染性cDNA的研究
• 2 猪瘟诊断方法
• 2.1 动物实验
• 2.2 病毒分离
• 2.3 免疫学诊断研究进展
• 2.4 分子生物学诊断技术
• 3 猪瘟新型疫苗研究进展
• 3.1 重组疫苗
• 3.2 亚单位疫苗
• 3.3 标记疫苗及其研究进展
• 3.4 核酸疫苗
• 参考文献
• 第一章 用杆状病毒系统表达猪瘟病毒E2蛋白主要抗原序列
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 2.1 E2基因片段RT-PCR扩增
• 2.2 重组转移载体的酶切鉴定及测序
• 2.3 重组表达载体的PCR鉴定
• 2.4 转染后的细胞病变
• 2.5 RT-PCR鉴定重组病毒
• 2.6 重组病毒的纯化
• 2.7 表达产物的鉴定
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二章 CSFV间接ELISA抗体检测方法的初步建立
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 2.1 间接ELISA试验最佳条件
• 2.2 判定标准
• 2.3 阻断试验
• 2.4 交叉试验
• 2.5 与猪瘟IDEXX抗体检测ELISA试剂盒比较
• 2.6 对各日龄猪血清的检测
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 附录
• 致谢