Burkholderia mana SYBC LI-1产脂肪酶发酵条件优化及酶学性质研究

论文摘要

脂肪酶是催化长链甘油三酰酯水解反应的酶,为重要的工业用酶之一。低温脂肪酶具有低温下高催化活性的特点,应用前景广阔。低温脂肪酶多数为极端嗜冷菌产生,极端嗜冷菌生长条件相对苛刻,产酶相对不易,严重制约了低温脂肪酶的发展。本论文从常温的自然生境土样中筛选出1株高产低温脂肪酶菌株。通过对其菌株形态、生理生化特性及16S rDNA分子鉴定,确定其为伯克霍尔德菌属（Burkholderia）,命名为Burkholderia mana SYBC LI-1。论文考察了菌株B. mana SYBC LI-1的摇瓶发酵培养情况,确定适宜的摇瓶发酵培养基为（g/L）:可溶性淀粉10、牛肉膏15、NaNO3 0.252、橄榄油40、OP 10;在发酵条件为接种量为（V/V）10%,装液量为30 mL/250 mL,30℃,初始pH 7.5,摇床转速200 r/min,培养48 h,脂肪酶酶活达85.23 U/mL,较优化前提高了3.63倍。论文对菌株B. mana SYBC LI-1脂肪酶的分离纯化进行了初步探讨,研究了硫酸铵分级沉淀﹑乙醇分级沉淀和双水相萃取（ATPS）3种大量纯化方法。其中ATPS适宜的体系为PEG 2000 （W/W） 10%,K2HPO4 （W/W） 15%,pH 8.0。在此条件下脂肪酶分配系数3.7,纯化系数4.1,回收率86.5%,对实际大规模制备有一定的参考价值。论文还对B. mana SYBC LI-1脂肪酶粗酶的酶学性质进行了研究,结果表明:该酶的最适pH为9.5,有较宽的pH稳定性,在pH 3.5～pH 10之间相对酶活均超过75%。该脂肪酶的最适作用温度为20℃,0℃时仍保留约70%的酶活,属于低温脂肪酶;对热不敏感,70℃以下保温60 min仍保持75%以上的酶活。在终浓度为1 mmol/L时,Fe2+及Fe3+均有较大的激活作用,Co2+和EDTA则表现较强的抑制作用。此外,该酶还表现较好的耐醇性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 研究背景
• 1.1.1 脂肪酶及其催化的反应
• 1.1.2 脂肪酶的分类及来源
• 1.1.3 脂肪酶的应用
• 1.1.4 低温脂肪酶
• 1.2 国内外研究进展
• 1.2.1 产脂肪酶菌株的选育
• 1.2.2 产脂肪酶微生物的发酵条件与培养基
• 1.2.3 脂肪酶的分离纯化
• 1.2.4 脂肪酶的酶学性质
• 1.3 立题依据
• 1.3.1 脂肪酶是重要的理论研究用酶
• 1.3.2 脂肪酶是重要的工业用酶
• 1.3.3 低温脂肪酶的意义
• 1.4 本论文的主要研究内容
• 第二章 脂肪酶高产细菌的筛选与鉴定
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 菌的筛选
• 2.3.2 菌株的形态学和生理生化特征
• 2.3.3 产脂肪酶菌株基于16S rDNA 序列的系统发育分析
• 2.3.4 脂肪酶酶活测定方法比较
• 2.4 讨论
• 第三章 B. MANA SYBC LI-1 产脂肪酶摇瓶发酵条件优化
• 3.1 前言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 B. mana SYBC LI-1 种子生长曲线
• 3.3.2 发酵培养基的确定
• 3.3.3 发酵培养条件的确定
• 3.3.4 正交优化试验
• 3.3.5 优化前后 B. mana SYBC LI-1 产脂肪酶情况的比较
• 3.3.6 优化前后 B. mana SYBC LI-1 产脂肪酶摇瓶发酵曲线
• 3.4 讨论
• 第四章 B. MANA SYBC LI-1 脂肪酶分离纯化
• 4.1 前言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 硫酸铵沉淀
• 4.3.2 乙醇沉淀
• 4.3.3 双水相萃取
• 4.3.4 3 种纯化方法比较
• 4.3.5 电泳分析
• 4.4 讨论
• 第五章 B. MANA SYBC LI-1 脂肪酶粗酶性质研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 实验方法
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 最适pH
• 5.3.2 pH 稳定性
• 5.3.3 最适温度
• 5.3.4 温度稳定性
• 5.3.5 金属离子或螯合物对酶活的影响
• 5.3.6 有机溶剂对酶活的影响
• 5.4 讨论
• 第六章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 作者在攻读硕士学位期间发表的论文