Holliday交叉解旋酶hGEN1功能的初步研究

论文摘要

细胞癌变的一个重要特征是基因组不稳定性。基因组稳定性机制包括细胞周期检验点、细胞分裂调控、DNA复制、DNA损伤修复、细胞凋亡等,是细胞维持自身平衡,精确调控增殖、分化、死亡程序的遗传学基础。其中DNA损伤修复对于维持基因组的稳定性至关重要,在多种内源或外源因素对细胞基因组造成不同形式的DNA损伤中,DNA双链断裂（DNA double-strand breaks, DSBs）是最致命的,单个没有得到正确修复的双链断裂就足以导致细胞毒性和基因组不稳定,最终引起癌症或促进过早老化。人源Holliday交叉解旋酶1G EN1参与DNA双链断裂修复。根据目前的报道,在体外利用生物化学的方法证明hGEN1具有Holliday交叉解旋酶活性,但GEN1基因缺陷的真核生物细胞（酵母、人和曲丽线虫）应对DNA损伤后的DNA修复和重组反应有显著差异,提示GEN1在体内可能参与除DNA双链断裂修复之外的其它基因组稳定性机制。而曲丽线虫的GEN1基因产物近期被证明参与了不依赖于ATR的DNA损伤信号传导反应,该功能独立于其DNA损伤修复活性,间接证明以上推测。我们通过构建GST标签的hGEN1原核表达系统,在体外表达及纯化了重组hGEN1-C端蛋白,制备了hGEN1的特异性抗体；确定了内源和外源1GEN1在细胞核和中心体上的定位,其中心体定位信号序列位于N端1-161碱基序列；已经克隆得到了经过Flag-IP/MS筛选到的hGEN1互作蛋白基因；进一步在hGEN1基因敲低的细胞中发现细胞分裂异常并且DNA复制受阻。以上数据表明,hGEN1在维持细胞的正常分裂及DNA复制方面发挥着重要的作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 前言
• 1.1 DNA损伤及修复
• 1.1.1 DNA损伤的类型
• 1.1.2 DNA修复的类型
• 1.2 Holliday交叉结构及解旋酶
• 1.2.1 Holliday交叉结构
• 1.2.2 Holliday交叉解旋酶
• 1.3 中心体
• 1.3.1 中心体的结构
• 1.3.2 中心体的复制
• 1.3.3 中心体与细胞分裂
• 1.3.4 中心体与细胞周期
• 1.3.5 中心体与肿瘤发生的关联
• 1.4 GEN1研究进展
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 感受态大肠杆菌的制备
• 2.2.2 RNA提取及逆转录PCR
• 2.2.3 表达载体的构建
• 2.2.4 蛋白质体外表达与纯化
• 2.2.5 细胞培养
• 2.2.6 细胞的转染
• 2.2.7 Western blot
• 2.2.8 考马斯亮蓝染色
• 2.2.9 免疫荧光
• 2.2.10 细胞的BrdU标记及细胞周期分析
• 2.2.11 siRNA转染方法
• 第三章 结果
• 3.1 hGEN1抗体制备
• 3.1.1 hGEN1基因的扩增
• 3.1.2 hGEN1的GST融合蛋白的表达
• 3.1.3 hGEN1抗体的纯化
• 3.1.4 hGEN1-C抗体特异性验证
• 3.1.5 hGEN1多肽抗体的制备
• 3.2 内源hGEN1胞中定位
• 3.2.1 内源hGEN1在胞中定位
• 3.2.2 内源hGEN1中心体定位确认
• 3.3 hGENl中心体定位片段
• 3.4. hGEN1表达水平敲低对细胞的影响
• 3.5 hGEN1与DNA复制的关系
• 3.6 hGEN1的互作基因
• 3.6.1 hGEN1互作网络分析
• 3.6.2 hGEN1互作蛋白基因的克隆
• 3.7 XN系统的构建
• 第四章 讨论
• 参考文献
• 致谢