TLR4在大鼠脑梗死组织中的动态表达及OMT抗炎机制的研究

论文摘要

目的:脑梗死后继发性脑损伤的病理生理机制复杂,其中过度炎症免疫反应存在于脑梗死后坏死及缺血区域,导致炎症损伤,此已成共识,因此减轻炎症损伤成为治疗急性脑梗死的主要途径之一。然而,在临床试验中抗炎治疗并没有取得预期的效果,或许这些药物抑制炎症通路的效果有限。Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）的发现促进了人们对炎症机制的理解,其中TLR4的结构及其参与促炎反应、促进免疫细胞成熟分化及调节免疫应答等方面研究的较为清楚。近年来,TLR4在非病原微生物性炎症损伤中的作用逐渐引起了人们的关注,发现其在脑梗死等非病原微生物性炎症损伤过程中具有重要的作用。氧化苦参碱（Oxymatrine,OMT）是从豆科槐属植物苦参（Sophora flavescens Ait）中提取的生物碱,具有四环的喹嗪啶类结构。OMT具有抗炎、抗氧化、抗病毒及免疫调节等多方面的药理作用,近几年对于OMT的研究很多,多集中在抗肝炎及抗肿瘤等方面,但关于氧化苦参碱对脑血管疾病的研究鲜有报道。本实验应用RT-PCR技术观察了不同剂量OMT对脑梗死大鼠脑组织TLR4 mRNA相对表达的影响,应用免疫组织化学方法观察OMT对脑梗死大鼠脑组织TLR4蛋白表达的影响,旨在从TLR4基因、蛋白水平探讨OMT抗炎作用机制。方法:80只健康雄性SD大鼠,体重250～300 g,随机分成4组:假手术组,生理盐水治疗组,大剂量OMT治疗组（120 mg/kg）,小剂量OMT治疗组（80 mg/kg）,每组根据不同的时间点又分为6 h、12 h、24 h、48 h四个亚组,每亚组均为5只大鼠。按照改良的线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞模型。将OMT以蒸馏水制成相同浓度混悬液（40 mg/ml）,大剂量OMT治疗组给予OMT 120 mg/kg,小剂量OMT治疗组给予OMT 80 mg/kg,生理盐水治疗组均给予1 ml生理盐水,各组均为腹腔注射给药,手术完毕后即刻给药一次,之后每天一次,直至相应时间点断头处死动物。假手术组,除不插线栓外其余操作同生理盐水治疗组。各实验组于相应时间点断头处死动物,无菌操作下取前囟前2 mm至前囟后3 mm脑组织,以前囟后0.5 mm为界分为前后两部分,前部分取梗死灶周围脑组织,快速称取100 mg,置冻存管中放入液氮保存待用,用于抽提总RNA,RT-PCR技术观察不同剂量OMT对脑梗死大鼠脑组织TLR4 mRNA相对表达的影响。后部分脑组织用4%多聚甲醛固定液固定24 h以上,但不能超过7 d,石蜡包埋,冠状切片,常规苏木精-伊红（Hemotoxylin-esion,HE）染色观察大鼠脑组织的病理改变,应用免疫组化法检测不同剂量OMT对脑梗死大鼠脑组织TLR4动态表达的影响。结果:1脑组织切片HE染色观察:假手术组无梗死灶,神经元结构、形态正常,无间质水肿。生理盐水治疗组、OMT小剂量治疗组可见缺血中心区组织疏松,形似海绵;神经元胞体缩小,变形、核固缩;间质水肿明显;随时间延长多形核白细胞（Polymorphonuclear leukocyte,PMN）浸润增多,其中PMN浸润在48 h最明显,OMT大剂量治疗组与生理盐水治疗组比较PMN浸润明显减轻。2各实验组脑组织TLR4 mRNA相对表达:各实验组各时间点TLR4 mRNA/β-actin mRNA灰度比值表明:各实验组各时间点TLR4 mRNA均有表达。假手术组与生理盐水治疗组、OMT小剂量治疗组及OMT大剂量治疗组比较,假手术6 h组为0.48±0.27,生理盐水6 h组为0.73±0.07,OMT小剂量6 h组为0.65±0.02,OMT大剂量6 h组为0.51±0.04,P<0.01,有统计学意义,其中生理盐水6 h组与OMT小剂量6 h组比较,P>0.05,无统计学意义,假手术6 h组与OMT大剂量6 h组比较,P>0.05,无统计学意义;假手术12 h组为0.50±0.01,生理盐水12 h组为0.91±0.07,OMT小剂量12 h组为0.81±0.09,OMT大剂量12 h组为0.68±0.10,P<0.01,有统计学意义,其中生理盐水12 h组与OMT小剂量12 h组比较,P>0.05,无统计学意义;假手术24 h组为0.50±0.00,生理盐水24 h组为1.09±0.10,OMT小剂量24 h组为0.99±0.11,OMT大剂量24 h组为0.77±0.01,P<0.01,有统计学意义,其中生理盐水24 h组与OMT小剂量24 h组比较,P>0.05,无统计学意义;假手术48 h组为0.49±0.03,生理盐水48 h组为1.14±0.18,OMT小剂量48 h组为1.01±0.04,OMT大剂量48 h组为0.82±0.05,P<0.01,有统计学意义,其中生理盐水48 h组与OMT小剂量48 h组比较,P>0.05,无统计学意义。3各实验组脑组织TLR4的动态表达:假手术组各时间点仅有少量TLR4表达;TLR4表达以小胶质细胞、神经元细胞为主,位于细胞胞浆内,室管膜和脑室脉络丛上皮细胞有弱阳性表达。假手术组与生理盐水治疗组、OMT小剂量治疗组、OMT大剂量治疗组比较,（以下数值单位均为“个”）假手术6 h组为0.48±0.18,生理盐水6 h组为1.64±0.24,OMT小剂量6 h组为1.14±0.21,OMT大剂量6 h组为0.63±0.07,P<0.01,有统计学意义,其中生理盐水6 h组与OMT小剂量6 h组比较,P>0.05,无统计学意义,假手术6 h组与OMT大剂量6 h组比较,P>0.05,无统计学意义;假手术12 h组为0.38±0.18,生理盐水12 h组为6.10±0.29,OMT小剂量12 h组为5.21±0.49,OMT大剂量12 h组为3.36±0.55,P<0.01,有统计学意义,其中生理盐水12 h组与OMT小剂量12 h组比较,P>0.05,无统计学意义;假手术24h组为0.44±0.17,生理盐水24 h组为10.42±0.79,OMT小剂量24 h组为8.91±0.32,OMT大剂量24 h组为6.33±0.63,P<0.01,有统计学意义,其中生理盐水24 h组与OMT小剂量24 h组比较,P>0.05,无统计学意义;假手术48 h组为0.40±0.25,生理盐水48 h组为10.67±0.99,OMT小剂量48 h组为9.32±0.70,OMT大剂量48 h组为6.54±0.89,P<0.01,有统计学意义,其中生理盐水48 h组与OMT小剂量48 h组比较,P>0.05,无统计学意义。结论:局灶性脑梗死后损伤组织释放的内源性激活物被TLR4识别,启动了TLR4的信号传导通路,进一步激活并释放致炎细胞因子而造成组织损伤。而氧化苦参碱可以降低TLR4基因、蛋白的表达,并且在一定剂量范围内呈量效关系,从而抑制之后一系列瀑布式炎症反应,并最终减轻脑损伤。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 TLR4 在大鼠脑梗死组织中的动态表达抗炎机制的研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 参考文献
• 综述 TOLL 样受体4 与脑缺血损伤
• 致谢
• 个人简历