植物核小体组装蛋白1（NAP1）家族成员的功能鉴定

论文摘要

真核生物基因组以高度折叠的染色质（Chromatin）形式贮存于细胞核内。染色质的基本结构和功能单位是核小体（Nucleosome）,其核心部分由大约146-147bp的DNA围绕着由各两个分子的H2A,H2B,H3和H4构成的组蛋白八聚体组成。核小体的正确组装对于重建有功能的染色质结构十分重要,影响着包括DNA复制,修复,重组,转录,细胞增殖与分化以及个体发育等诸多生物过程。核小体组装需要组蛋白分子伴侣的参与,组蛋白分子伴侣不仅影响着染色质的结构形成及动态调节,而且参与到组蛋白的储存,核质运输以及组蛋白在染色质组装过程中的掺入和替换。NAP1（Nucleosome Assembly Protein 1）是目前被确认的在各物种（酵母,动物和植物）中都保守存在的组蛋白H2A-H2B分子伴侣。通过去除/替换染色质上的组蛋白H2A/H2B,或者通过调节核小体的滑动,NAP1可以改变染色质的结构及调节染色质的代谢,进而影响细胞分化和个体发育等过程。果蝇和老鼠中的遗传学研究结果表明一个NAP1同源基因的缺失会导致胚胎致死,说明了NAP1蛋白在胚胎发育中的重要功能。NAP1蛋白在植物中也是高度保守的,而目前有关植物NAP1蛋白的结构和功能研究还处于起步阶段。我的博士论文主要利用分子生物学、生物化学、细胞生物学以及遗传学等研究手段分析了高等植物NAP1家族成员的功能及其对植物生长发育的影响。我博士论文的第一部分工作主要对水稻和烟草NAP1家族成员进行了分子和生化分析。我们实验室利用筛选cDNA文库的方法,分离到3个水稻NAP1基因和4个烟草NAP1基因（Dong et al.,2003.Planta 216,561-570）。我们证明了烟草NAP1蛋白可以结合组蛋白H2A-H2B,我们的结果支持了NAP1作为H2A-H2B分子伴侣的模式在植物中也是保守的。对NAP1的结合蛋白的分析表明烟草NAP1蛋白可以和微管蛋白及有丝分裂细胞周期蛋白Nicta;CYCB1:1结合,暗示其在微管动力学调控上的潜在功能。利用绿色荧光蛋白作为标记,我进一步研究了水稻和烟草NAP1家族成员的亚细胞定位。核定位输出抑制剂LMB处理以及核定位输出信号突变实验表明Orysa;NAP1;1和Nicta;NAP1;1可以在细胞质和细胞核中穿梭。比较有趣的是,其它三个烟草NAP1蛋白以及Orysa;NAP1;2只定位于细胞质中,而且并不具有核、质穿梭能力。此外,Orysa;NAP1;3缺少典型的核定位信号,但却在细胞核和细胞质中均有分布。我们还发现只有Orysa;NAP1;3可以在体外被酪蛋白激酶2（CK2,Casein kinase 2）磷酸化。然而,通过点突变分析,我们却发现Orysa;NAP1;3的磷酸化并不影响该蛋白的亚细胞定位。以上结果已发表于Plant Physiology杂志。由于拟南芥作为模式植物在遗传分析上具有巨大的优势,我们转而利用拟南芥系统对NAP1家族蛋白进行功能研究。拟南芥编码4个NAP1基因,我们发现其中一个基因（AtNAP1;4）特异表达于雄蕊以及根延长区的部分,而其它三个NAP1基因则全局表达。更进一步,我们发现拟南芥NAP1蛋白可以形成同源和异源二聚体,同时他们也可以结合植物的组蛋白H2A和H2B。在我们实验室的标准生长条件下,三个全局表达的NAP1基因的缺失的两个三突变（Atnap1;1-1Atnap1;2-1Atnap1;3-1和Atnap1;1-1Atnap1;2-1Atnap1;3-2）未表现出任何明显表型。而通过各种DNA损伤试剂的处理,我们发现这两个三突变表现出中等强度的紫外（UV-C）敏感以及体外修复DNA损伤的能力降低。两个三突变的转录谱和染色质免疫共沉淀分析表明拟南芥NAP1蛋白可以直接结合到一些核苷酸剪切修复（NER,Nucleotide excision repair）途径基因的启动子上,并调节这些基因的表达。这些结果提示拟南芥NAP1家族成员蛋白保守地行使组蛋白H2A/H2B分子伴侣的功能,并且参与调节核苷酸剪切修复途径。有趣的是,三突变的转录谱还表明,除了核苷酸剪切修复途径基因外,某些激素和压力应答相关基因的表达也发生了改变,提示我们去研究NAP1蛋白在植物对激素和压力应答方面的功能。我们发现三突变Atnap1;1-1Atnap1;2-1Atnap1;3-1表现出对脱落酸（ABA,Abscisic acid）的轻微超敏感。相反,Atnap1;1-1Atnap1;2-1Atnap1;3-2则在苗的生长和气孔活动方面比较强烈地表现出对脱落酸的不敏感,并导致该三突变植株盐耐受性的降低。此外,所有含有Atnap1;3-2等位的突变体以及Atnap1;3-2杂合子都表现对脱落酸的脱敏性。更细致的研究表明在所有含有Atnap1;3-2等位的突变体以及Atnap1;3-2杂合子中均存在一个AtNAP1;3的截短蛋白（碳末端34个氨基酸缺失,命名为AtNAP1;3T）。过量表达这个截短蛋白导致植物对脱落酸的脱敏,并导致一些ABA信号转导途径基因的表达降低,证实该AtNAP1;3T可能通过调节这些基因的表达显性影响拟南芥对脱落酸的反应。综上所述,我的博士论文工作比较深入地阐述了植物NAP1家族成员的分子、细胞和生物学功能,表明植物NAP1蛋白参与基因表达调控以及对非生物逆境的反应。

论文目录

• 摘要
• Summary
• Ⅰ ABBREVIATIONS
• Ⅱ INTRODUCTION
• Ⅱ-1 Chromatin and nucleosome
• Ⅱ-1-1 Chromatin structure
• Ⅱ-1-1-1 Heterochromatin and euchromatin
• Ⅱ-1-1-2 Nucleosome
• Ⅱ-1-1-2-1 Nucleosomes as units of genomic organization
• Ⅱ-1-1-2-2 Nucleosomes as units of transcriptional regulation
• Ⅱ-1-2 Regulation of chromatin structure
• Ⅱ-1-2-1 ATP-dependent chromatin remodeling
• Ⅱ-1-2-2 Histone replacement by histone variants
• Ⅱ-1-2-2-1 H2A variants
• Ⅱ-1-2-2-2 H3 variants
• Ⅱ-1-2-3 Histone covalent modifications
• Ⅱ-2 Chromatin assembly and histone chaperones
• Ⅱ-2-1 Chromatin assembly
• Ⅱ-2-1-1 Nucleosome assembly:deposition of histone dimers
• Ⅱ-2-1-2 Compaction of nucleosome arrays
• Ⅱ-2-1-3 Higher-order chromatin structures
• Ⅱ-2-2 Histone chaperones
• Ⅱ-2-2-1 Highly conserved histone chaperones
• Ⅱ-2-2-1-1 CAF-1（Chromatin Assembly Factor-1）
• Ⅱ-2-2-1-2 HIRA（Histone regulation A）
• Ⅱ-2-2-1-3 Asf1（Anti-silencing function 1）
• Ⅱ-2-2-1-4 Spt6
• Ⅱ-2-2-1-5 FACT（Faciliates chromatin transcription） complex
• Ⅱ-2-2-1-6 Nucleolin
• Ⅱ-2-2-1-7 NAP1（Nucleosome Assembly Protein 1）
• Ⅱ-2-2-1-7-1 NAP1 structure,postsynthetic modifications,histone shuttling,and oligomerization states
• Ⅱ-2-2-1-7-2 Histone binding activity of NAP1
• Ⅱ-2-2-1-7-3 Chaperone activity of NAP1
• Ⅱ-2-2-1-7-4 TAF-1β/SET
• Ⅱ-2-2-2 Species-specific histone chaperones
• Ⅱ-2-2-2-1 N1/N2
• Ⅱ-2-2-2-2 FKBP（The FK506-binding protein）
• Ⅱ-2-2-2-3 JDP2（Jun dimerization protein 2）
• Ⅱ-2-2-2-4 Rtt106
• Ⅱ-2-2-2-5 Protein 6b
• Ⅱ-2-2-2-6 NPM（Nucleoplasmin/nucleophosmin）
• Ⅱ-2-2-2-7 Chz1（chaperone for H2A.Z-H2B1）
• Ⅱ-2-2-3 Linker histone chaperones
• Ⅱ-2-2-4 Histone chaperone-like proteins
• Ⅱ-3 Chromatin remodeling and its function in response to environmental factors
• Ⅱ-4 Objective of my work
• Ⅱ-5 Review published
• Ⅲ RESULTS
• Ⅲ-1 Molecular characterization of rice and tobacco NAP1 proteins
• Ⅲ-2 Molecular characterization of Arabidopsis NAP1 proteins
• Ⅲ-2-1 NUCLEOSOME ASSEMBLY PROTEIN1（NAP1） Is Involved in Nucleotide Excision Repair in Arabidopsis thaliana
• Ⅲ-2-2 A truncated NUCELOSOME ASSEMBLY PROTEIN1,AtNAP1;3-T,affects Arabidopsis response to abscisic acid
• Ⅳ GENERAL DISCUSSION AND PERSPECTIVES
• Ⅳ-1 NAP1 family genes in plants
• Ⅳ-2 Subcellular localization of plant NAP1 family proteins
• Ⅳ-3 More histone H2A/H2B chaperones in plants
• Ⅳ-4 NAP1 and transcription
• Ⅳ-5 NAP1 in DNA repair
• Ⅳ-6 NAP1 in ABA signaling
• Ⅳ-7 Other functions of plant NAP1 proteins
• Ⅳ-8 Perspective
• Ⅴ MATERIALS AND METHODS
• Ⅴ-1 Materials
• Ⅴ-1-1 Plant Materials
• Ⅴ-1-2 Bacteria strains
• Ⅴ-1-2-1 Escherichia coli
• Ⅴ-1-2-2 Agrobacterium tumefaciens
• Ⅴ-1-3 Cloning and expression vectors
• Ⅴ-1-4 Antibodies
• Ⅴ-1-5 Antibiotics
• Ⅴ-1-6 Chemicals
• Ⅴ-1-7 Oligos
• Ⅴ-2 Methods
• Ⅴ-2-1 General techniques in molecular biology
• Ⅴ-2-1-1 Vector construction
• Ⅴ-2-1-1-1 PCR（Polymerase Chain Reaction）
• Ⅴ-2-1-1-2 Restriction enzyme digestion
• Ⅴ-2-1-1-3 Agarose gel electrophoresis
• Ⅴ-2-1-1-4 Ligation
• Ⅴ-2-1-1-5 Competent cell preparation
• Ⅴ-2-1-1-6 Transformation of competent cells
• Ⅴ-2-1-1-7 Mini-preparation of plasmid DNA by alkaline lysis with SDS
• Ⅴ-2-1-2 Genomic DNA isolation
• Ⅴ-2-1-3 RNA isolation and analysis
• Ⅴ-2-1-3-1 Total RNA extraction
• Ⅴ-2-1-3-2 Reverse transcription
• Ⅴ-2-1-3-3 Electrophoretic separation of RNAs
• Ⅴ-2-1-3-4 Transfer of RNA to membrane
• Ⅴ-2-1-3-5 Northern hybridization
• Ⅴ-2-1-4 Quantitative PCR analysis
• Ⅴ-2-1-5 Protein expression,purification and detection
• Ⅴ-2-1-5-1 Protein expression in E.Coli
• Ⅴ-2-1-5-2 Purification of expressed proteins from E.Coli
• Ⅴ-2-1-5-3 Separation of proteins by SDS-PAGE
• Ⅴ-2-1-5-4 Western blot
• Ⅴ-2-1-5-5 Pull down assay
• Ⅴ-2-1-5-6 Co-Immunoprecipitation analysis
• Ⅴ-2-1-5-7 Subcellular Protein Fractionation
• Ⅴ-2-1-7 In vitro CK2 phosphorylation assay
• Ⅴ-2-2 Tobacco BY2 cells culture and transformation
• Ⅴ-2-2-1 TBY2 cell culture
• Ⅴ-2-2-2 TBY2 cell transformation
• Ⅴ-2-3 Arabidopsis thaliana culture and transformation
• Ⅴ-2-3-1 Arabidopsis culture
• Ⅴ-2-3-2 Arabidopsis transformation by flower dip method
• Ⅴ-2-4 Chromatin immunoprecipitation（ChIP）
• Ⅴ-2-5 Yeast Two-Hybrid Screening and Assays
• Ⅴ-2-6 Phenotype analysis of ABA and salt treatment
• Ⅴ-2-7 GUS-reporter Construction and Enzyme Activity Assay
• Ⅴ-2-8 UV treatment and In Vitro DNA Repair Assay
• Ⅴ-2-9 Microarray
• Ⅵ REFERENCES
• Acknowledgements