高效石油降解细菌的筛选鉴定和菌群构建

论文摘要

石油开采及其加工品的大量使用,在世界范围里造成土壤环境石油污染日益严重,对生态环境及人类健康造成严重危害。石油是一种碳氢混合物,可以作为自然环境中部分微生物的碳源和能源分解利用,因此从自然环境筛选高效石油降解菌并构建高效菌群,对于石油污染土壤生物修复有重要意义。本文从高效石油降解菌的筛选及菌群构建的目的出发,开展了一系列研究工作,主要研究结果为:（1）采用三种培养条件对不同来源石油污染土壤细进行富集培养,运用传统的微生物分离技术对富集菌群进行了分离纯化,根据菌落特征,筛选获得了40株纯菌株。根据纯菌株变性梯度凝胶电泳法（DGGE）图谱中的迁移率,将40个纯菌株初步划分为17个种类,对17个代表菌株石油降解能力的测定结果表明:不同菌株石油降解率范围在17.6%77.9%,其中有10个株降解率高于40%,有3个菌株降解率高于70%。（2）对分离得到的石油高效降解菌16S rDNA扩增、测序,并进行同源性分析,其中有7个菌株与芽孢杆菌、短波单胞菌、铜绿假单胞菌、食碱杆菌、假单胞菌、类产碱假单胞菌、无色杆菌相似性为100%。（3）对石油高效降解菌株与石油降解能力有关的脱氢酶和邻苯二酚2,3-双加氧酶活性进行了测定,结果表明,7个株菌脱氢酶活性范围在7.0119.0 mg·L-1·h-1,邻苯二酚2,3-双加氧酶活性范围在0.220.87U,添加诱导物柴油提高了供试菌株邻苯二酚2,3-双加氧酶活性,范围为3.348.98U,不同菌株之间酶活性存在不同程度的差异,其中无色杆菌S-51脱氢酶活性最高,单胞菌S-17邻苯二酚2,3-双加氧酶活性（C23Oase）活性最高。同一培养条件下供试菌株细胞裂解液和培养液上清中C23Oase活性有显著的差异,暗示C23Oase为胞内酶。（4）采用3种培养基,对4个不同取样来源的石油污染土壤细菌进行富集驯化,获得12个混合菌群,其对石油降解率范围在44%86.8%之间,不同菌群降解能力存在明显差异。利用PCR-DGGE技术对混合菌群优势菌多样性及混合菌群间同源性分析结果表明:不同土壤样品在相同富集培养条件下混合菌群多样性差异较小,而同一土壤样品在不同富集培养条件下混合菌多样性差异明显。（6）通过12组混合菌与纯化高效菌株同步DGGE图谱比对,选择在混合菌中出现几率较高的纯菌进行人工组合,实验初步得到三组高效菌群,包括S-10和S-15组合,S-10和S-51组合,S-13、S-15和S-36组合,柴油降解率分别高达86.8%、87.5 %、81.3%。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 文献综述
• 1 土壤石油污染危害
• 2 土壤石油污染微生物修复
• 3 降解石油的微生物种类
• 4 微生物对烃的传输和摄取
• 5 石油烃类的降解途径
• 5.1 烷烃的降解
• 5.2 环烷烃的降解
• 5.3 芳香烃的降解
• 6 微生物降解石油的影响因素
• 6.1 环境因素
• 6.2 生物因素
• 6.3 石油烃状况
• 7 分子生物学技术在石油微生物研究中的应用
• 7.1 聚合酶链式反应法
• 7.2 165 rRNA 序列分析
• 7.3 变性梯度凝胶电泳
• 8 石油污染微生物修复发展方向
• 8.1 同生菌群的培养
• 8.2 表面活性剂的应用
• 8.3 降解菌的质粒研究与基因工程菌的开发
• 8.4 加强系统工程的研究
• 第二部分 实验方法与结果
• 1 材料与方法
• 1.1 石油降解菌菌种来源
• 1.2 不同来源石油降解菌的分离
• 1.2.1 石油中石油烃降解菌的分离
• 1.2.2 土壤中石油烃降解菌的富集及分离纯化
• 1.3 石油降解菌基于PCR-DGGE 法的分析鉴定
• 1.3.1 纯化菌株和混合菌群DNA 的提取
• 1.3.2 纯化菌株及混合菌群的PCR-DGGE
• 1.3.3 石油降解菌纯菌株的测序与进化树的构建
• 1.4 石油降解菌株和富集混合菌的石油烃降解能力研究
• 1.4.1 石油降解菌株的石油烃降解能力研究
• 1.4.2 富集混合菌的石油烃降解能力研究
• 1.5 高效石油降解菌酶学性质研究
• 1.5.1 脱氢酶活性测定
• 1.5.2 邻苯二酚2，3-双加氧酶活性测定
• 1.6 高效石油降解菌群的构建
• 1.6.1 石油降解微生物菌群构建原则及方法
• 1.6.2 组合菌柴油降解能力测定
• 2 结果与分析
• 2.1 不同来源细菌分离结果
• 2.2 石油降解菌株的PCR-DGGE 分析
• 2.2.1 纯菌株DNA 提取和165 rDNA V3 区扩增结果
• 2.2.2 纯菌株DGGE 结果
• 2.3 纯菌株和富集混合菌群石油降解能力分析
• 2.4 高效石油降解菌株的测序与进化树的构建
• 2.4.1 纯菌株165 rDNA 扩增结果
• 2.4.2 同源性分析及进化树的建立
• 2.5 高效石油降解菌株的脱氢酶和邻苯二酚2,3-双加氧酶活性
• 2.5.1 石油降解菌脱氢酶活性
• 2.5.2 石油降解菌邻苯二酚2，3-双加氧酶活性
• 2.6 富集培养混合菌PCR-DGGE 分析
• 2.6.1 混合菌DNA 提取和165 rDNA V3 区扩增结果
• 2.6.2 不同富集条件下混合菌DGGE 分析
• 2.6.3 不同富集条件下混合菌DGGE 结果与纯菌株DGGE 结果的比对
• 2.7 石油降解组合菌群的构建及其柴油降解能力分析
• 2.7.1 石油降解组合菌群的构建依据
• 2.7.2 石油降解组合菌群柴油降解能力的分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 致谢