水稻MAPKK基因家族表达模式分析及其功能初探

论文摘要

促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）途径在植物生长发育和生物与非生物胁迫响应方面起到了重要的作用。在水稻中,促分裂原活化蛋白激酶激酶基因（MAPKKs）的抗逆功能依然不清楚。本研究通过表达序列标签（EST）和cDNA的数据比对的方法搜寻水稻数据库,得到了9个水稻促分裂原活化蛋白激酶激酶基因（OsMKKs）。本研究的主要内容如下:1、OsMKKs在不同器官下的特异表达研究:通过荧光定量PCR检测了OsMKKs在日本晴不同器官（叶,根和花）下的表达情况,发现其表达具有组织特异性。OsMKK1,OsMKK3,OsMKK4,OsMKK5,OsMKK6和OsMKK10-2在叶,根和花中都有表达,在根中表达有差异。而OsMKK8,OsMKK9和OsMKK10-1在不同器官中的表达丰度很低,主要在根和花中表达。2、OsMKKs在生物或非生物胁迫下的表达研究。分别用双氧水（H2O2）,水杨酸（Sa]icylic acid,SA）,脱落酸（abscisic acid,ABA）,甲基茉莉酸（methyl jasmonic acid,Me-JA）,甘露醇,氯化钠和低温（4℃）模拟各种不同的逆境,采用荧光定量PCR检测OsMKKs在不同逆境处理下的表达情况。发现不同OsMKKs的表达具有时空特异性。全基因组表达分析表明:OsMKK1在七种逆境信号处理下均有上升表达,且30分钟之前到达最高表达,具有早期表达特性。在H2O2,SA,Mannitiol,NaCl诱导下在根中启动表达要早,且表达量较高。而在ABA,Me-JA,低温诱导下则相反。OsMKK3在七种逆境信号处理下表达情况比较复杂,在Mannitiol,NaCl和低温诱导下表达量大幅度上升,在SA,ABA和Me-JA诱导下叶和根中表达模式不同,在SA诱导的早期,根中表达上升而叶中表达下降,ABA和Me-JA诱导下则相反。在H2O2处理下早期下降表达。OsMKK4在H2O2,MeJA和Mannitiol诱导下早期有上升表达,在ABA,NaCl和低温（4℃）诱导下早期在叶中有上升表达,在根中则相反。在SA诱导下早期下降表达。OsMKK5在H2O2,SA,ABA,Me-JA,Mannitiol和NaCl诱导下有上升表达。其中在H2O2诱导下晚期表达,NaCl和ABA诱导下早期表达;在SA,Mannitiol诱导下在根中早期表达,叶中晚期表达,而Me-JA诱导下则相反。低温（4℃）诱导下在叶中有上升表达,在根中下降表达。OsMKK6在H2O2、SA、ABA、Me-JA、Mannitiol、NaCl和低温诱导下均有上升表达。其中SA,NaCl和低温诱导下早期表达,在H2O2诱导下晚期表达;在ABA,Mannitiol诱导下在根中早期表达,叶中晚期表达,而Me-JA诱导下则相反。OsMKK8,OsMKK9在不同处理下均没有检测到表达。OsMKK10-1在H2O2,SA,NaCl和低温诱导下均有上升表达。其中在H2O2诱导下晚期表达,SA,NaCl和低温诱导下早期表达。OsMKK10-2在H2O2诱导下有上升表达,其中在H2O2诱导下根中早期表达,叶中晚期表达。在低温诱导的早期下降表达,在SA,ABA,Me-JA,Mannitiol和NaCl诱导的早期在叶和根中的表达情况不同,其中在ABA,Me-JA诱导下叶中上升表达,在根中下降表达;其他则相反。3、克隆了OsMKK3,构建了超表达和抑制表达载体,并分别被用于转化水稻、烟草和拟南芥。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 MAPK信号传递级联系统在真核生物界的防卫机制
• 1.2 植物中MAPKs与抗逆性的研究介绍
• 1.2.1 植物抗性相关的信号传导途径
• 1.2.2 MAPK传递链在植物逆境反应中的作用
• 1.2.3 传递链在植物激素调控中的作用
• 1.2.4 化学诱导剂与MAPK传递链
• 1.3 植物MAPKK激酶信号研究进展
• 1.4 荧光定量PCR研究技术
• 1.5 转基因功能的验证相关的技术
• 1.5.1 农杆菌介导转化技术
• 1.5.1.1 农杆菌介导转化机理
• 1.5.1.2 农杆菌介导转化的特点
• 1.5.1.3 农杆菌介导转化方法的适用范围及局限性
• 1.5.2 RNA干涉技术
• 1.5.2.1 RNA干涉技术原理
• 1.5.2.2 RNA干涉的功能和意义
• 1.5.2.3 RNA干涉技术的特点和方法
• 1.5.2.4 RNA干涉技术在植物中的应用
• 1.6 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 材料种植
• 2.1.3 细菌培养基
• 2.1.4 感受态细胞制备、蓝白斑筛选溶液
• 2.1.5 常用缓冲液
• 2.1.6 抗生素母液
• 2.1.7 用于转化的培养基
• 2.1.8 菌株
• 2.1.9 载体
• 2.1.10 酶和其他试剂
• 2.1.11 常用实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 日本晴不同处理的RNA的提取
• 2.2.2 荧光定量PCR
• 2.2.2.1 RNA浓度的测定
• 2.2.2.2 第一链cDNA的合成
• 2.2.2.3 荧光定量PCR
• 2.2.3 植物表达载体的构建
• 2.2.3.1 超表达载体的构建
• 2.2.3.2 抑制表达载体的构建
• 2.2.4 表达载体导入根癌农杆菌
• 2.2.4.1 农杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.4.2 冻融法导入根癌农杆菌EHA105菌株
• 2.2.5 叶盘法转化烟草
• 2.2.5.1 农杆菌的培养
• 2.2.5.2 共培养
• 2.2.5.3 诱导丛生芽
• 2.2.5.4 诱导生根
• 2.2.5.5 转基因烟草的PCR检测
• 2.2.6 农杆菌介导的水稻转化
• 2.2.6.1 外植体的消毒及愈伤组织诱导
• 2.2.6.2 愈伤组织继代培养
• 2.2.6.3 愈伤组织预培养
• 2.2.6.4 农杆菌的培养
• 2.2.6.5 农杆菌转化与共培养
• 2.2.6.6 抗性愈伤组织筛选
• 2.2.6.7 愈伤组织预分化培养
• 2.2.6.8 愈伤组织分化与植株再生
• 2.2.6.9 诱导生根及移栽
• 2.2.6.10 转基因材料的PCR检测
• 2.2.7 农杆菌介导的拟南芥转化
• 2.2.7.1 拟南芥转化（FLORAL DIP）
• 2.2.7.2 潜在转化株系的筛选
• 2.2.7.3 转基因材料的PCR检测
• 3 结果与分析
• 3.1 OsMKKs基因的序列的寻找及分析
• 3.1.1 OsMKKs基因序列的寻找
• 3.1.2 OsMKKs染色体定位
• 3.1.3 OsMKKs同源性分析
• 3.2 水稻MAPKK基因家族的表达模式分析
• 3.2.1 OsMKKs特异序列的引物设计与验证
• 3.2.2 OsMKKs在不同器官下表达分析
• 3.2.3 OsMKKs在不同逆境下的表达分析
• 3.2.3.1 OsMKK1表达分析
• 3.2.3.2 OsMKK3表达分析
• 3.2.3.3 OsMKK4表达分析
• 3.2.3.4 OsMKK5表达分析
• 3.2.3.5 OsMKK6表达分析
• 3.2.3.6 OsMKK8,9表达分析
• 3.2.3.7 OsMKK10-1表达分析
• 3.2.3.8 OsMKK10-2表达分析
• 3.3 OsMKK3的克隆及转基因分析
• 3.3.1 OsMKK3的克隆
• 3.3.2 载体构建
• 3.3.2.1 中间载体构建
• 3.3.2.2 超表达载体构建
• 3.3.2.3 抑制表达载体构建
• 3.3.3 转基因植株的获得
• 3.3.3.1 烟草转化工作
• 3.3.3.2 水稻转化工作
• 3.3.3.3 拟南芥转化工作
• 4 讨论
• 4.1 OsMKKs组织特异性表达与相关的讨论
• 4.2 OsMKKs不同逆境表达模式分析与相关功能的讨论
• 4.3 关于表达载体构建
• 4.4 在转基因中遇到的问题
• 4.5 希望以后开展的工作
• 参考文献
• 附录
• 致谢