拟南芥神经酰胺酶基因的功能分析

论文摘要

鞘脂（Sphingolipids）是含有长链鞘样碱基骨架的一类结构复杂的脂类分子,在哺乳动物和酵母中鞘脂及其代谢产物是重要的信号分子。近几年才开始对植物中的鞘脂进行研究,目前植物鞘脂的功能还不十分清楚,然而最近的研究发现鞘脂及其代谢产物在植物中也起着很重要的信号作用。神经酰胺是鞘脂的基本结构单位,是最简单的鞘脂,也是鞘脂代谢途径的中心分子。随着鞘脂在动物和酵母中的深入研究发现,神经酰胺及其衍生物不仅是细胞膜结构的重要组成成分,还是一类很重要生物活性分子,它们作为第二信使参与调节细胞的生长、分化、衰老和程序性细胞死亡等许多重要的信号转导过程。神经酰胺的代谢受多种酶的调控,一些与神经酰胺相关的酶已经报道。神经酰胺通过神经酰胺酶水解生成脂肪酸和长链基团,它是以神经酰胺为中心的鞘脂代谢途径的重要组成部分。目前为止,动物和酵母方面关于神经酰胺酶的功能还不太清楚,植物神经酰胺酶的功能也未见报道。因此本文选择模式植物拟南芥为研究对象,来阐明植物中神经酰胺酶的主要功能。本文以拟南芥野生型（Col）和神经酰胺酶突变体（cer）为实验材料,通过一系列生理生化指标的测定,来研究拟南芥神经酰胺酶基因（AtCER）的生物学功能。利用PCR和Northern blot获得了9个AtCER纯合单突变体。通过构建拟南芥神经酰胺酶三个基因的启动子各自与GUS报告基因融合载体,成功获得了启动子融合GUS报告基因的转基因植物,并进行GUS染色,初步的表达分析表明这三个基因主要在根尖和维管组织中表达。Northern杂交分析显示它们的表达受多种非生物因素的诱导,如ABA、NaCl、甘露醇、SA、冷害等。H202处理试验发现突变体叶片出现比野生型更严重的黄化现象和坏死斑点,总叶绿素含量也比野生型下降了2-4倍,这表明突变体对H202的反应比野生型更加敏感。电导率测定结果显示H202处理后突变体的电导率比野生型升高更多,其抗氧化酶活性比野生型增加了1.5-3倍。上述研究结果说明AtCER参与了H202诱导的氧化胁迫反应。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 植物鞘脂的结构
• 1.1.1 鞘氨醇长链
• 1.1.2 脂肪酰胺
• 1.1.3 极性头基团
• 1.2 植物鞘脂的代谢途径
• 1.3 植物鞘脂的功能
• 1.3.1 膜组成成分
• 1.3.2 细胞生长与死亡
• 1.3.3 细胞信号
• 1.3.4 非生物逆境反应
• 1.3.5 病原性防御
• 1.4 植物鞘脂功能研究的展望
• 1.4.1 神经酰胺
• 1.4.2 不同鞘脂间的相对平衡水平
• 1.4.3 植物鞘脂代谢的相关酶
• 1.4.4 植物鞘脂与人类健康
• 1.5 本文的研究意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.2 所用试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 核酸提取
• 2×CTAB法提取总DNA
• LiCl法大量提取RNA
• 2.3.2 质粒构建
• PCR反应
• 玻璃珠法胶回收DNA
• 质粒DNA转化大肠杆菌
• Mini质粒DNA提取
• 2.3.3 农杆菌转化
• 农杆菌CV3101菌株感受态细胞制备
• 表达载体转化农杆菌
• 农杆菌介导法转化拟南芥
• 2.3.4 Northem杂交
• 2.3.5 GUS染色
• 2.3.6 生理生化指标测定
• 植物叶片内源H2O2含量的测定
• 电导率的测定
• 总叶绿素含量的测定
• 酶的提取和分析
• 第三章 实验结果
• 3.1 三个拟南芥神经酰胺酶基因的表达
• 3.2 拟南芥神经酰胺酶基因突变体的获得
• 3.3 CER基因在不同逆境胁迫中的表达
• 2O₂处理的响应'>3.4 CER突变体对H₂O₂处理的响应
• 2O₂处理后叶片总叶绿素含量的变化'>3.5 H₂O₂处理后叶片总叶绿素含量的变化
• 2O₂对植物叶片电导率的影响'>3.6 H₂O₂对植物叶片电导率的影响
• 2O₂处理下植物叶片的抗氧化酶活性变化'>3.7 H₂O₂处理下植物叶片的抗氧化酶活性变化
• 第四章 讨论
• 4.1 ATCER的表达模式
• 4.2 ATCER可能调控逆境胁迫反应
• 4.3 ATCER可能影响质膜的稳定性和渗透性
• 4.4 ATCER可能调控氧化胁迫反应
• 第五章 小结
• 参考文献
• 附录
• 论文发表情况
• 致谢