自组装纳米载体用于基因输送的研究

论文摘要

基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞,以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,从而达到治疗目的。但是,目前基因治疗遇到诸多挑战,其中最大的挑战是如何获得高效安全的基因输送载体。基因载体分为病毒载体和非病毒载体。相对于病毒载体,非病毒载体具有安全性能高和可大规模应用的优点,但其基因表达效率低,且体内体外基因转染效率不一致。本文的工作目标是制备适于体内应用且具有体内高转染效率的新型基因输送体系。聚乙烯亚胺（PEI）在体外具有高转染效率,已被广泛用于体外基因输送。但PEI与DNA形成的复合物（polyplexes）带正电荷,与血液中蛋白质有非特异性相互作用,导致血液浓度半衰期短。在复合物表面通过静电相互作用包裹一层带负电的聚合物可以降低这种非特异性作用,但带负电荷的聚合物会与DNA竞争络和PEI,导致复合物稳定性变差,复合物在血液中就有可能解开。同时,PEI与DNA之间强的静电相互作用,使他们的复合物在细胞核中不容易解开,因此DNA不容易被表达。本工作的设计思路是：PEI与DNA复合后通过细胞内可断裂键进行高度交联,然后包裹聚阴离子聚合物。因此,即使聚阴离子聚合物与PEI作用,DNA也不会被释放出来；而在细胞内,交联键断裂后,由于聚阴离子与PEI的竞争络和,使DNA容易被释放出来,从而使DNA容易被表达,提高基因转染效率。本论文以PEI为基础,设计了交联的PEI/DNA复合物,并用聚阴离子对PEI/DNA复合物表面进行修饰,形成“三明治”型基因输送体系,初步探讨了它们的体内基因输送的能力。第一个工作是肝素（HP）包埋的可逆交联PEI/DNA复合物作为体内靶向基因输送体系。首先制备了PEI/DNA复合物,并用二硫键对该复合物进行交联,交联后的复合物更加稳定。再用肝素包埋该复合物,形成HP/PEI/DNA复合物,其纳米粒径在100 nm左右,在血清和高盐溶液中具有良好的稳定性,且细胞毒性低。考察了该基因输送体系在体内肿瘤部位基因转染效率,将带有EGFP报告基因的质粒转染接种有人源乳腺癌的裸鼠,结果检测到裸鼠肿瘤部位高度表达绿色荧光蛋白,并通过免疫组化实验证实,表明该基因输送体系具有在体内应用的潜力。第二个工作是用透明质酸（HA）包埋的PEI-Dexa/DNA复合物。HA具有良好的“不黏附”性能,阻止复合物的非特异性作用,但它良好的“不黏附”性能也使得复合物很难进入细胞。有些肿瘤细胞高表达HA受体,因此,HA包裹的复合物可通过受体介导的细胞内吞进入肿瘤细胞。地塞米松（Dexa）具有核靶向能力,因此引入Dexa到复合物上来可进一步提高其入核能力。因此,制备了HA包埋的PEI-Dexa/DNA复合物。首先将Dexa共价连接到PEI （MW25 kDa）链上,考察了地塞米松的引入对细胞毒性和细胞转染效率的影响。结果表明,地塞米松修饰后,细胞毒性有所降低但转染效率可能由于Dexa的屏蔽作用较PEI （MW25 kDa）略降低。其次,用透明质酸包埋形成的HA/PEI-Dexa/DNA复合物对高表达HA受体的细胞株的转染效率高于HA受体阴性的细胞株,表明HA的引入对HA受体阳性的细胞的转染具有促进作用。第三种是用阴离子脂质体包埋PEI/DNA复合物。本工作目的是初步探讨利用脂质体与细胞膜融合的能力制备模拟病毒体的基因输送体系。初步制备了阴离子脂质体包埋的Lipid/PEI/DNA复合物,发现颗粒表面携带负电荷,具有体内应用的潜力,但由于该基因输送体系表面带强的负电性,即使加入靶向基团叶酸,在细胞水平的转染效率仍然很低。因此,还需对阴离子脂质体的种类等进行优化,以获得转染效率高的基因输送体系。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写、符号清单和术语表
• 第一章 前言
• 1.1 基因治疗
• 1.1.1 基因治疗原理及意义
• 1.1.2 基因输送过程
• 1.2 基因载体的基本分类
• 1.2.1 病毒载体
• 1.2.2 非病毒载体
• 1.2.2.1 脂质体
• 1.2.2.2 阳离子聚合物
• 1.2.2.3 其他聚合物
• 1.3 基于阳离子聚合物基因输送体系的制备方法
• 1.3.1 体外聚合物/DNA复合物制备方法
• 1.3.2 体内稳定聚合物/DNA复合物制备方法
• 1.3.2.1 引入PEG
• 1.3.2.2 "三明治"法
• 1.4 非病毒基因输送载体目前存在的问题
• 1.5 课题的提出
• 第二章 实验材料与仪器
• 2.1 实验试剂
• 2.2 实验仪器
• 2.3 质粒
• 2.4 细胞
• 2.5 试剂盒
• 2.6 工作溶液
• 2.6.1 常规溶液
• 2.6.2 MTT实验所用
• 第三章 肝素包埋可逆交联PEI/DNA复合物作为体内靶向基因输送体系的研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 质粒扩增与提取
• 3.2.1.1 大肠杆菌DH5α的培养
• 3.2.1.2 质粒提取
• 3.2.2 交联剂DSP的合成
• 3.2.3 肝素-叶酸（HP-FA）的合成
• 3.2.4 HP/PEI/DNA纳米复合物制备
• 3.2.5 纳米复合物物理性能测定
• 3.2.6 纳米复合物稳定性试验
• 3.2.6.1 纳米复合物对肝素的抗解离性能
• 3.2.6.2 纳米复合物在盐溶液中的稳定性
• 3.2.7 DNA释放
• 3.2.8 细胞毒性实验
• 3.2.9 纳米复合物亚细胞分布实验
• 3.2.10 纳米复合物体内分布实验
• 3.2.12 体内肿瘤基因表达实验
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 交联剂DSP和HP-FA的化学表征
• 3.3.2 纳米复合物动态光散射表征
• 3.3.3 交联度对纳米复合物的影响
• 3.3.4 HP-FA量对复合物纳米颗粒表面电势及大小的影响
• 3.3.5 纳米复合物稳定性
• 3.3.5.1 纳米复合物对肝素的抗解离性能
• 3.3.5.2 纳米复合物在盐溶液中的稳定性
• 3.3.6 DNA释放
• 3.3.7 细胞毒性实验
• 3.3.8 纳米复合物亚细胞分布
• 3.3.9 纳米复合物体内分布
• 3.3.10 体内肿瘤基因表达
• 3.4 本章小结
• 第四章 透明质酸包埋PEI-Dexa/DNA复合物作为靶向基因输送体系的研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 聚乙烯亚胺-地塞米松（PEI-Dexa）的合成及表征
• 4.2.2 PEI-Dexa缓冲能力表征
• 4.2.3 PEI-Dexa/DNA纳米复合物的制备
• 4.2.4 HA包埋PEI-Dexa/DNA纳米复合物的制备
• 4.2.5 纳米复合物物理性能测定
• 4.2.6 琼脂糖凝胶电泳阻滞试验
• 4.2.7 细胞毒性实验
• 4.2.8 细胞转染实验
• 4.3 实验结果与讨论
• 4.3.1 聚乙烯亚胺-地塞米松（PEI-Dexa）的表征
• 4.3.2 PEI-Dexa缓冲能力表征
• 4.3.3 PEI-Dexa/DNA纳米复合物动态光散射表征
• 4.3.4 HA/PEI-Dexa/DNA纳米复合物动态光散射表征
• 4.3.5 琼脂糖凝胶电泳阻滞试验
• 4.3.6 聚合物细胞毒性
• 4.3.7 细胞转染
• 4.4 本章小结
• 第五章 阴离子脂质体包埋PEI-Dexa/DNA复合物作为基因输送体系的研究
• 5.1 引言
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 阴离子脂质体制备
• 5.2.2 脂质体包埋PEI-Dexa/DNA纳米复合物制备
• 5.2.3 纳米复合物物理性能测定
• 5.2.4 细胞转染实验
• 5.3 实验结果与讨论
• 5.3.1 阴离子脂质体制备
• 5.3.2 脂质体/PEI-Dexa/DNA纳米复合物动态光散射表征
• 5.3.3 细胞转染
• 5.4 本章小结
• 参考文献
• 科研成果