沙冬青与根瘤菌和丛枝菌根真菌（AMF）共生关系影响因素的研究

论文摘要

荒漠珍稀常绿固沙植物沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus （Maxim.））在北京乃至北方地区引种应用的研究较少。根瘤菌和丛枝菌根真菌（AMF）有助于沙冬青在贫瘠、干旱的土壤中生长,从单一方面,对两者各有较多的研究。然而,从共生菌角度将两方面结合起来对这种三位一体的共生关系的研究很少。本论文在同课题组前人对沙冬青引种研究的基础上,利用土著根瘤菌株、丛枝菌根真菌（AMF）,对引种过程中的共生菌种培养筛选,并对三者共生关系的影响因素进行深入研究,结合扫描、透射电镜和X-射线能谱分析技术,对根瘤发育过程以及Ca2+在此过程中的动态分布进行了分析,以更进一步的揭示Ca2+在根瘤发育和固氮功能发挥中的作用以及对沙冬青生长的影响,填补了国内外该领域研究的空白,具有一定的创新意义。主要研究结果如下:1.确定菌剂的培养条件。分离得到18个沙冬青根瘤菌株,分离出沙冬青一种土著优势菌种Glomous.claroideum Schenk& Smith,并通过纯培养制成AMF菌剂。通过根瘤回接试验确定了3株比较优良的根瘤菌株ZW1、AZ1和DK1-2。筛选出产孢量最高的河沙做AMF菌剂的培养基质和0.4mmol.L-1的P水平作为最适的培养浓度。进一步试验发现,此P水平同样适用于接种AMF菌剂的沙冬青生长。2.研究了不同矿质元素对沙冬青生长的影响,发现缺乏N、P、K、Mg、Ca、Fe等元素对沙冬青观赏形态特征和生长量影响极大,生长受不同程度的抑制,尤其当缺乏N、P、K时,生长近乎停滞;对根瘤菌与沙冬青共生所需的N营养进行了研究,在不同N水平下对沙冬青接种根瘤菌剂,发现N水平在0-3.75mmol.L-1下,根系结瘤良好。3.通过AMF、根瘤菌双接种初步筛选后,利用对其生长效应较好的根瘤菌株ZW1、AZ1和AMF菌剂G.c、G.v,对沙冬青再次进行接种比较,筛选出对其生长效应有比较显著促进效果的共生菌组合ZW1+G.v。试验发现单接种土著菌剂G.c对沙冬青没有促进效果,但与两个根瘤菌株双接种后,能显著地促进其侵染效果,明显提高了沙冬青对G.c的依赖性,显示了土著菌剂之间的相互协同促进作用。较之单接种和对照,双接种对沙冬青的整体生长量、菌根侵染和根系结瘤等综合效应都有显著促进,但相互之间有明显差异,说明根瘤菌株和AMF菌剂之间也存在选择匹配与协同作用。菌剂ZW1+G.v组合对沙冬青的综合促进作用最明显,生长量是对照的171.0%,但未使沙冬青对其依赖性达到中等强度,可能与试验环境条件有关。4.筛选出对AMF、根瘤菌和沙冬青共生互作效应有促进效果的类黄酮。对三种AMF菌剂单接种以及AMF与根瘤菌双接种组合施加2种不同浓度的类黄酮apigenin、hesperitin,发现同一种类黄酮的不同浓度(1.5μmol.L-1和0.15μmol.L-1、15μmol.L-1)处理对不同单接种菌剂效果不一样,差异显著,两种类黄酮之间也存在差异。综合来说,以1.5μmol.L-1类黄酮对沙冬青生长量、结瘤、菌剂的菌根侵染和菌丝酶活性效果较为显著。15μmol.L-1处理hesperitin对部分菌剂的酶活性和菌丝生长表现出明显的抑制作用,但对菌根侵染率和植株生长没有明显作用。说明AMF--根瘤菌--沙冬青共生体系对类黄酮的种类比较敏感,但对其浓度更为敏感。结果证明,对于具体菌剂组合,选择合适的类黄酮能促进AMF和根瘤菌之间的协同效应。5.对沙冬青根瘤菌的侵染途径与根瘤发育的过程进行了研究;研究信号物质结瘤因子粗体物（nf）、类黄酮、Ca2+诱导根毛变形的情况以及ABA对根毛变形和沙冬青生长与结瘤的影响。根瘤菌主要从根毛入侵,形成侵染线,深入到根内中柱附近的内皮层细胞形成根瘤原基,发育成瘤。试验发现前三者均对根毛变形有诱导作用,nf浓度与活性越高,所诱导的根毛变形率也越高。类黄酮处理中1.5μmol.L-1高于0.15μmol.L-1,而hesperitin处理高于同一浓度的apigenin处理。在0-10mmol.L-1时,根毛变形率随Ca2+浓度上升而升高,在Ca2+溶液中加入结瘤因子后,根毛变形率显著升高。但Ca2+在20 mmol.L-1时,根毛变形率有所下降。植物激素ABA在低浓度时对沙冬青根毛变形和沙冬青生长与结瘤作用不明显,但高浓度(1、5μmol.L-1)时抑制作用非常显著,根毛变形率和植株生长量、结瘤量都迅速下降,加入ABA抑制剂钨酸钠可缓解其抑制作用。根瘤菌株ZW1所处理的植株生长量比AZ1处理的变化幅度更大,对ABA更为敏感,可能与两者原产地的环境状况有关。6.研究了根瘤不同发育时期显微与超微结构的变化,光学电镜观察到根瘤菌侵染过程,其根瘤具有永久分生组织,属于无限型类型。透射电镜观察研究显示,根瘤细胞的发育过程可分为:侵染前期、侵染线形成入侵期、侵染初期、发育期、成熟期、成熟后期和衰老早期、衰老后期。侵染前期分生细胞和相邻的内皮层细胞中出现胞质桥,为即将侵染做准备。早期侵染细胞中,细胞核较大,质体（含淀粉粒）丰富,细胞壁、细胞膜沉积,形成大量的侵染线,内陷成袋状深入到细胞内部释放根瘤菌,根瘤菌小,数量少,没有聚羟基丁酸（PHB白色颗粒）,圆形或椭圆形,迅速分裂增殖。发育至成熟侵染细胞中,根瘤菌发育成类菌体,一至多个包被在周膜中;个体较大、数量较多、形状多样,逐渐充满整个细胞,类菌体中含有较多的PHB颗粒。成熟后期菌体互相挤压在一起,PHB消失;至衰老前期类菌体膜质分离, PHB又大量出现,细胞质减少,透明度增加。在衰老的侵染细胞中,类菌体解体,呈团絮状或膜泡状结构,PHB则基本没有。7.对不同时期根瘤的Ca2+进行了定性定量分析,揭示了Ca2+对根瘤发育、结构变化与功能的影响。通过透射电镜、扫描电镜观察到Ca2+分布的变化和X-射线能谱仪对总Ca的定量分析,证实根瘤发育与Ca2+的含量和分布密切相关。在根瘤菌初侵染期,高浓度的Ca2+对侵染线在细胞间隙的推进、入侵与降解和根瘤菌的增殖发育有促进作用。发育期,Ca2+分布量大为降低,但仍然非常丰富,对类菌体与其周膜、宿主细胞进行信息和物质交换有促进作用。在成熟期,Ca2+和总钙量降至最低,恢复到植物细胞正常状态下的Ca2+浓度与分布量,从而保持共生体系细胞结构的稳定性,利于类菌体保持固氮酶活性,发挥固氮作用。成熟后期至衰老初期,Ca2+的猛然上升导致在细胞质中大量积聚,破坏了细胞中的平衡状态,细胞和类菌体开始衰老。衰老后期Ca2+量仍然保持较高状态,类菌体解体,根瘤进入衰亡状态。而在初侵染组织和中下部成熟侵染组织中,均出现部分细胞的细胞质浓缩消解、类菌体过早衰败的细胞程序化（PCD）死亡现象,而两个部位的Ca2+均是大量积聚,相对含量过高,因此猜测其分布量导致类菌体和细胞衰亡。原因可能是根瘤自身通过细胞中的酶和Ca2+量的变化来调正结构和功能需求,使中心组织内适当的保留一部分非侵染细胞。在根瘤整个发育进程中,细胞内Ca2+的分布是不均匀的,Ca2+的变化具有明显的时间和空间异质性,这与其参与不同的生理活动有关,在根瘤发育和固氮功能的发挥上起着非常重要的作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 沙冬青研究概述
• 1.1.1 区系分布的研究
• 1.1.2 珍稀濒危原因与迁地保护的研究
• 1.1.3 生物学特性及生境的研究
• 1.1.4 抗旱抗寒机理的研究
• 1.1.5 利用价值方面的研究
• 1.1.6 生态学方面的研究
• 1.1.7 组织培养研究
• 1.2 根瘤形成发育过程以及影响因素的研究
• 1.2.1 根瘤形成发育的影响因素
• 1.2.1.1 结瘤因子在根瘤发育过程中的作用
• 1.2.1.2 类黄酮在根瘤发育中的作用
• 1.2.1.3 氮在根瘤发育过程中的作用
• 2+在植物——根瘤菌互作过程中的作用'>1.2.1.4 Ca²⁺在植物——根瘤菌互作过程中的作用
• 1.2.1.5 植物激素ABA 等在植物——根瘤菌互作过程中的作用
• 1.2.2 根瘤形成过程的研究
• 1.3 AMF 与根瘤菌联合共生研究及应用
• 1.3.1 AMF 在豆科固氮植物中形成的普遍性
• 1.3.2 类黄酮对丛枝菌根侵染定殖的影响
• 1.3.3 AMF—根瘤菌共生作用研究
• 1.3.3.1 双接种对植物营养吸收与生长的研究
• 1.3.3.2 AMF 菌根技术在固氮植物上的应用前景
• 1.3.4 AMF—根瘤菌—豆科植物作用机理探讨
• 1.3.4.1 N、P 等营养元素互补的机理研究
• 1.3.4.2 分子水平上的研究
• 1.4 本研究的目的与意义
• 1.5 本研究主要技术路线
• 2 沙冬青根瘤菌菌株与丛枝菌根真菌（AMF）的分离、培养及高效组合筛选
• 2.1 与沙冬青共生根瘤菌菌株的分离、回接试验
• 2.1.1 根瘤分离、纯化
• 2.1.1.1 材料准备
• 2.1.1.2 根瘤菌分离、纯化与保存方法
• 2.1.2 回接试验
• 2.1.2.1 种源及接种方法
• 2.1.2.2 实验设计
• 2.1.2.3 管理措施
• 2.1.3 结果与分析
• 2.1.3.1 菌株鉴定
• 2.1.3.2 回接实验结果
• 2.2 丛枝菌根真菌（AMF）菌剂的富集培养研究
• 2.2.1 材料与方法
• 2.2.1.1 宿主植物及播种方法
• 2.2.1.2 供试AMF 菌种
• 2.2.1.3 不同培养基质对AMF 侵染与孢子产量的影响
• 2.2.1.4 不同P 水平处理对AMF 侵染与孢子产量的影响
• 2.2.1.5 管理与统计
• 2.2.2 结果与分析
• 2.2.2.1 不同培养基质对AMF 侵染与孢子产量的影响
• 2.2.2.2 不同P 水平对AMF 侵染与孢子产量的影响
• 2.3 根瘤菌和AMF 高效菌剂组合的初步筛选
• 2.3.1 材料与方法
• 2.3.1.1 时间和地点
• 2.3.1.2 种源及播种方法
• 2.3.1.3 营养液配制与浇施
• 2.3.1.4 试验处理方法
• 2.3.1.5 统计指标
• 2.3.2 结果与分析
• 2.3.2.1 不同菌剂组合处理的对幼苗生长的影响
• 2.3.2.2 不同菌剂组合的处理对结瘤的影响
• 2.3.2.3 不同菌剂组合的处理对菌根侵染的影响
• 2.4 讨论
• 2.4.1 根瘤菌株的分离与回接
• 2.4.2 AMF 菌剂的培养
• 2.4.3 菌剂组合的筛选
• 3 共生菌与沙冬青幼苗生长和矿质元素关系的研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 时间和地点
• 3.1.2 种源及播种方法
• 3.1.3 营养液配制
• 3.1.4 试验设计
• 3.1.4.1 不同营养元素对幼苗生长的影响
• 3.1.4.2 不同氮素水平下对幼苗结瘤的影响
• 3.1.4.3 不同磷素水平下AMF 菌剂对幼苗生长的影响
• 3.1.5 测定指标及数据处理
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 不同矿质营养元素对沙冬青幼苗生长的影响
• 3.2.1.1 株高生长量
• 3.2.1.2 茎粗生长量
• 3.2.1.3 叶绿素含量
• 3.2.1.4 干重分析
• 3.2.2 不同矿质营养元素对沙冬青幼苗形态特征和生长状况的影响
• 3.2.3 不同氮素水平对沙冬青生长量和结瘤量的影响
• 3.2.3.1 氮素供应对沙冬青生长量的影响
• 3.2.3.2 氮素供应对结瘤的影响
• 3.2.4 不同P 水平对幼苗生长的影响
• 3.2.4.1 不同P 水平处理对地上部和总干重的影响
• 3.2.4.2 不同P 水平处理对地下部生长的影响
• 3.2.4.3 不同P 水平处理对AMF 菌根侵染率的影响
• 3.3 讨论
• 4 AMF 与根瘤菌互作对沙冬青生长促进效应的研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 试验处理
• 4.1.3 测定指标与方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 AMF 和根瘤菌双接种对沙冬青生长的影响
• 4.2.2 AMF 和根瘤菌双接种对沙冬青根系结瘤的影响
• 4.2.3 AMF 和根瘤菌双接种对菌根侵染的影响
• 4.2.4 AMF 和根瘤菌双接种在沙冬青根系中的侵染状况
• 4.3 讨论
• 5 类黄酮对AMF、根瘤菌接种于沙冬青互作效果的影响
• 5.1 类黄酮对AMF 接种沙冬青效果的研究
• 5.1.1 材料与方法
• 5.1.1.1 供试材料
• 5.1.1.2 试验处理方法
• 5.1.1.3 取样和AM 真菌感染根段台盼兰（Trypan blue）染色
• 5.1.1.4 土壤中AM 真菌菌丝总量的测定
• 5.1.1.5 ALP 和SDH 酶活染色
• 5.1.1.6 统计分析
• 5.1.2 结果与分析
• 5.1.2.1 类黄酮对接种AMF 的沙冬青生长量的影响
• 5.1.2.2 类黄酮对AMF 侵染沙冬青的影响
• 5.1.2.3 类黄酮对AMF 菌丝SDH 和ALP 酶活性的影响
• 5.1.3 结果与分析
• 5.2 类黄酮对AMF 与根瘤菌互作效果的影响
• 5.2.1 材料与方法
• 5.2.1.1 供试材料
• 5.2.1.2 试验处理方法
• 5.2.1.3 指标测定
• 5.2.1.4 ALP 和SDH 酶活染色
• 5.2.1.5 统计分析
• 5.2.2 结果与分析
• 5.2.2.1 类黄酮对接种后沙冬青生长量的影响
• 5.2.2.2 类黄酮对沙冬青结瘤的影响
• 5.2.2.3 类黄酮对AMF 菌根侵染率的影响
• 5.2.2.4 类黄酮对AMF 菌丝ALP 和SDH 酶活性的影响
• 5.3 讨论
• 6 沙冬青根瘤菌入侵途径与根毛变形影响因素的研究
• 6.1 根瘤菌入侵途径的研究
• 6.1.1 材料和方法
• 6.1.2 沙冬青根部形态变化观察
• 6.1.3 根瘤菌入侵途径的观察
• 6.2 沙冬青根毛变形影响因素的研究
• 6.2.1 结瘤因子粗提物对根毛变形的影响
• 6.2.1.1 材料与方法
• 6.2.1.2 试验设计与统计
• 6.2.2 类黄酮对诱导沙冬青根毛变形的影响
• 6.2.2.1 材料和方法
• 6.2.2.2 试验处理方法
• 6.2.2.3 方法
• 2+对根毛变形的影响'>6.2.3 Ca²⁺对根毛变形的影响
• 6.2.3.1 材料和方法
• 6.2.3.2 试验设计与统计
• 6.3 ABA 对根毛变形与沙冬青生长、结瘤的影响
• 6.3.1 材料和方法
• 6.3.2 试验设计与方法
• 6.4 结果与分析
• 6.4.1 根瘤菌入侵途径与根瘤形成过程的研究
• 6.4.1.1 根瘤形成发育过程
• 6.4.1.2 根瘤菌入侵途径
• 6.4.2 影响根毛变形的因素
• 6.4.2.1 不同结瘤因子水平对根毛变形的影响
• 6.4.2.2 不同类黄酮水平对根毛变形的影响
• 2+水平对根毛变形的影响'>6.4.2.3 不同Ca²⁺水平对根毛变形的影响
• 6.4.3 不同ABA 水平对幼苗生长与结瘤的影响
• 6.4.3.1 ABA 对沙冬青生长量的影响
• 6.4.3.2 ABA 对沙冬青根系结瘤的影响
• 6.4.3.3 钨酸钠对沙冬青生长量与结瘤的影响
• 6.5 讨论
• 2+动态变化的研究'>7 沙冬青根瘤发育过程中超微结构及Ca²⁺动态变化的研究
• 2+的动态变化'>7.1 沙冬青根瘤菌发育过程与Ca²⁺的动态变化
• 7.1.1 根瘤发育过程的研究
• 2+定位的超薄切片制作'>7.1.2 Ca²⁺定位的超薄切片制作
• 7.1.2.1 试剂的制备
• 7.1.2.2 材料
• 7.1.2.3 方法
• 7.1.3 不同发育时期根瘤中总Ca 的定量、定性分析
• 7.1.3.1 材料
• 7.1.3.2 方法
• 7.1.3.3 仪器及工作状态
• 7.1.3.4 分析指标
• 7.2 结果与分析
• 7.2.1 根瘤发育过程的观察
• 2+的动态分布'>7.2.2 根瘤发育进程超微结构与Ca²⁺的动态分布
• 7.2.3 根瘤发育过程中总Ca 含量的定性与定量分析
• 7.2.3.1 不同发育期的根瘤整体总Ca 含量分析
• 7.2.3.2 根瘤发育过程中不同部位总Ca 含量分析
• 7.3 讨论
• 7.3.1 根瘤类型与发育过程
• 7.3.2 根瘤菌发育过程中的超微结构变化
• 2+与根瘤菌发育进程和超微结构的关系'>7.3.3 Ca²⁺与根瘤菌发育进程和超微结构的关系
• 7.3.4 根瘤不同发育时期、不同部位总Ca 含量的分析
• 8 结论
• 参考文献
• 图版
• 个人简历
• 导师简介
• 致谢