重组人血管活性肠肽(VIP)和Humanin(HN)融合蛋白在大肠杆菌中的表达及分离纯化

重组人血管活性肠肽(VIP)和Humanin(HN)融合蛋白在大肠杆菌中的表达及分离纯化

论文摘要

血管活性肠肽(VIP)和Humanin(HN)都是具有神经保护作用的多肽,他们都能抵抗β-淀粉样蛋白的毒性而起到保护作用。因此都对阿尔茨海默病有一定的治疗作用。本研究首次利用基因工程的方法克隆并串联表达rhVIP-HN,借助金属螯合层析找到最适合大规模生产的分离纯化途径。将合成的VIP-HN基因的引物片段通过PCR的方法获得完整的VIP-HN基因,经测序正确后,将VIP-HN基因克隆入pET-28a(+)表达载体中。最后将重组质粒转化入BL21(DE3)中即获得表达菌株。筛选高效表达菌株,摇瓶培养基因工程大肠杆菌生长3h,菌体密度达到OD600=0.6-0.7时,加入诱导剂,诱导剂IPTG终浓度为1mmol/L;诱导6h;诱导温度为37℃。重组VIP-HN在大肠杆菌中表达时易形成不溶性、无活性的包涵体,需经过体外变性复性分离等步骤才能获得纯度较高的重组VIP-HN.由于利用pET28a(+)表达载体表达的融合蛋白都带有6个组氨酸的纯化标签,所以选用金属螯合树脂作为分离介质。据此设计了三种分离纯化途径:1、将变性液先稀释复性后再经金属螯合树脂分离。2、直接用变性液经金属螯合树脂分离后,再经透析复性。3、复性与分离同时在金属螯合树脂上完成。通过计算纯化后目标蛋白产量及条带扫描确定蛋白纯度,发现第三种途径即复性与分离同时在金属螯合树脂上完成这一途径每克包涵体可产生46mg rhVIP-HN,并且纯度可达90%。分离得到的rhVIP-HN经MALDI-TOF-TOF质谱分析,捕获片段的分子量和理论值差距在允许范围内,这表明分离得到的rhVIP-HN具有正确的一级结构。实验结果表明重组血管活性肠肽和Humanin融合蛋白在大肠杆菌中可以正确表达,并且通过比较三种分离途径发现利用金属螯合层析将复性和分离同时进行是最节省时间和缓冲液的一种途径,而且操作简单。这为大规模生产rhVIP-HN寻找到了一个最简便的途径。

论文目录

  • 学位论文数据集
  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 目录
  • 第一章 绪论
  • 1.1 血管活性肠肽(VIP)和Humanin(HN)的研究现状
  • 1.1.1 血管活性肠肽(VIP)
  • 1.1.2 HUMANIN(HN)
  • 1.2 血管活性肠肽(VIP)和Humanin(HN)的生物学作用及机制
  • 1.2.1 VIP的生物学作用及机制
  • 1.2.1.1 VIP对消化系肿瘤的影响
  • 1.2.1.2 VIP与呼吸系统疾病
  • 1.2.1.3 VIP与神经系统疾病
  • 1.2.2 HN的生物学作用和机制
  • 1.3 大肠杆菌表达系统
  • 1.3.1 用大肠杆菌进行基因表达的一般策略
  • 1.3.2 影响基因重组蛋白质在大肠杆菌中表达的因素
  • 1.3.2.1 影响转录水平的因素
  • 1.3.2.2 影响翻译水平的因素
  • 1.3.2.3 宿主的选择和培养条件的控制
  • 1.3.3 外源蛋白在大肠杆菌中的表达形式
  • 1.4 重组蛋白的包涵体体外复性研究
  • 1.4.1 包涵体的形成与分离
  • 1.4.2 包涵体的变性与体外复性
  • 1.5 重组蛋白的分离纯化
  • 1.5.1 层析技术
  • 1.5.1.1 层析方法的选择
  • 1.5.1.2 亲和层析
  • 1.5.1.3 其他方法
  • 本章小结
  • 第二章 rhVIP-HN基因的克隆
  • 2.1 试验材料与仪器
  • 2.2 实验方法
  • 2.3 结果分析讨论
  • 本章小结
  • 第三章 rhVIP-HN基因表达条件的研究
  • 3.1 实验材料与仪器
  • 3.1.1 培养基及试剂
  • 3.1.2 实验仪器
  • 3.2 实验方法
  • 3.2.1 菌种活化
  • 3.2.2 种子液的培养
  • 3.2.3 发酵培养
  • 3.2.4 包涵体的制备
  • 3.2.5 粗制包涵体的洗涤
  • 3.2.6 包涵体的溶解
  • 3.3 分析方法
  • 3.3.1 紫外分光光度计测菌体浓度
  • 3.3.2 SDS-PAGE凝胶电泳
  • 3.3.3 电泳条带扫描
  • 3.4 结果分析讨论
  • 本章小结
  • 第四章 rhVIP-HN的分离纯化与鉴定
  • 4.1 实验材料和仪器
  • 4.1.1 实验材料
  • 4.1.2 实验仪器
  • 4.2 实验方法
  • 4.2.1 分离缓冲液PH值的选择
  • 4.2.2 先复性再分离(途径一)
  • 4.2.3 先分离后复性(途径二)
  • 4.2.4 复性和分离同时完成(途径三)
  • 4.2.5 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法鉴定rhVIP-HN
  • 4.3 结果及分析
  • 4.3.1 分离缓冲液的PH
  • 4.3.2 甘油的添加对复性的影响
  • 4.3.3 目标蛋白的分离
  • 4.3.4 三种复性分离途径的比较
  • 4.3.5 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法鉴定RHVIP-HN
  • 本章小结
  • 第五章 结论和建议
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢
  • 攻读学位期间发表的学术论文目录
  • 作者和导师简介
  • 附件
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