论文摘要
血管活性肠肽(VIP)和Humanin(HN)都是具有神经保护作用的多肽,他们都能抵抗β-淀粉样蛋白的毒性而起到保护作用。因此都对阿尔茨海默病有一定的治疗作用。本研究首次利用基因工程的方法克隆并串联表达rhVIP-HN,借助金属螯合层析找到最适合大规模生产的分离纯化途径。将合成的VIP-HN基因的引物片段通过PCR的方法获得完整的VIP-HN基因,经测序正确后,将VIP-HN基因克隆入pET-28a(+)表达载体中。最后将重组质粒转化入BL21(DE3)中即获得表达菌株。筛选高效表达菌株,摇瓶培养基因工程大肠杆菌生长3h,菌体密度达到OD600=0.6-0.7时,加入诱导剂,诱导剂IPTG终浓度为1mmol/L;诱导6h;诱导温度为37℃。重组VIP-HN在大肠杆菌中表达时易形成不溶性、无活性的包涵体,需经过体外变性复性分离等步骤才能获得纯度较高的重组VIP-HN.由于利用pET28a(+)表达载体表达的融合蛋白都带有6个组氨酸的纯化标签,所以选用金属螯合树脂作为分离介质。据此设计了三种分离纯化途径:1、将变性液先稀释复性后再经金属螯合树脂分离。2、直接用变性液经金属螯合树脂分离后,再经透析复性。3、复性与分离同时在金属螯合树脂上完成。通过计算纯化后目标蛋白产量及条带扫描确定蛋白纯度,发现第三种途径即复性与分离同时在金属螯合树脂上完成这一途径每克包涵体可产生46mg rhVIP-HN,并且纯度可达90%。分离得到的rhVIP-HN经MALDI-TOF-TOF质谱分析,捕获片段的分子量和理论值差距在允许范围内,这表明分离得到的rhVIP-HN具有正确的一级结构。实验结果表明重组血管活性肠肽和Humanin融合蛋白在大肠杆菌中可以正确表达,并且通过比较三种分离途径发现利用金属螯合层析将复性和分离同时进行是最节省时间和缓冲液的一种途径,而且操作简单。这为大规模生产rhVIP-HN寻找到了一个最简便的途径。
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