论文摘要
研究背景和目的肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）,是一种常见的恶性肿瘤,其恶性程度极高。HCC是肝癌中最常见的一种组织学类型,70%到85%的肝癌都为HCC。HCC高发于东南亚、非洲、南欧等地区,我国也是高发区之一。在全球范围内,肝癌在男性常见恶性肿瘤发病率中居第5位,女性居第7位；为第2位的男性癌症死亡原因,第6位的女性癌症死亡原因。据全球癌症最新统计显示,肝癌在2008年全球共有74.83万新发病例,69.59万死亡病例。这其中半数以上的新发和死亡病例都发生在中国。肝癌是我国第二大的癌症死亡原因,死亡率为26.26/10万,男性肝癌的发病率为37.9/10万,女性则为14.2/10万。肝癌已成为威胁我国人民健康的重大问题。目前临床上可用于治疗肝癌的手段包括手术切除、全身化学治疗、经肝动脉介入化疗、放射治疗、导向治疗、免疫治疗、肝癌局部冷冻、激光、微波、酒精注射、射频消融治疗、肝移植等,且多靶点抗肿瘤新药索拉非尼（sorafenib,多吉美）的出现也使肝癌在药物治疗上取得了重大突破。目前肝癌的一线治疗方法仍为肝移植或手术切除。然而80%的HCC患者确诊时已为病变晚期,失去手术治疗机会。即使是根治性切除后5年复发率仍为54.1%-61.5%,小肝癌为43.5%,术后两年内为复发高峰期。而化放疗和局部治疗后的转移复发率更高。如何预防肿瘤转移复发已成为提高肝癌患者生存率的关键。因此,寻找肝癌分子靶向治疗靶点和合适的生物标志物来预测肿瘤转移倾向、判断肿瘤预后已成为探索预防和治疗肝癌中的热点问题。EpCAM （Epithelial cell adhesion molecule,上皮细胞黏附分子,又称CD326、CO17-1A、EGP、EGP40、GA733-2、KSA、Ly74、M1S2、M4S1、MIC18、MK-1、TROP1和hEGP-2）蛋白是39-42KD大小的Ⅰ型跨膜糖蛋白。它由胞外域、跨膜域和由26个氨基酸组成的胞浆域（又称EpICD）构成,其胞外域又由表皮生长因子样重复序列和甲状腺球蛋白样重复序列组成。EpCAM蛋白由位于4号染色体长臂上的GA733-2基因编码。最初发现EpCAM是结肠癌中的优势抗原,抗体治疗中的一个小的细胞黏附分子和细胞表面结合位点。EpCAM在人类许多上皮组织、肿瘤组织和干细胞中均有表达。它表达在几乎所有的腺癌、某一些鳞癌、视网膜细胞瘤和肝癌中。目前研究发现EpCAM是肿瘤细胞增殖的标志,也是肝癌干细胞的表面标志。EpCAM参与Wnt/β-catenin这个与肿瘤发生发展密切相关的信号通路的调节。研究表明通过RNA干扰使EpCAM基因沉默,能使乳腺癌细胞及胃癌细胞的增殖,迁移及侵袭能力下降,提示EpCAM在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。RNA干扰（RNA interference, RNAi）是由双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA）介导的,由特定酶参与的特异性基因沉默现象。它通过人为地引入与内源性靶基因具有相同序列的dsRNA,从而诱导内源靶基因的1nRNA高效特异性降解,达到阻止基因表达的目的。RNAi其特征为：①RNAi属于转录后水平的基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS）;②RNAi的特异性：只能引起同源基因表达的抑制,而无关基因不受影响,只降解与之序列相对应的单个内源靶基因的mRNA;③RNAi的高效性：很少量的dsRNA分子就能完全抑制相应基因的表达,RNAi存在瀑布放大效应,每个细胞仅需几分子siRNA就可产生RNAi效应,并可达到缺失突变体表型的程度；④RNAi的可扩散性和可遗传性：RNAi抑制基因表达的效应可在不同细胞间传递和维持信号,引起其他细胞的基因沉默。RNAi的效应是长效的,在一定的细胞周期内具有可遗传性。具有短发夹结构的双链RNA稳定性较好,而且能延长目的基因沉默的时间；⑤siRNA的结构特征是：长度为21-23nt,双链两端均有两个突出的3’碱基,5’端有磷酸基团。这些结构对于维持其功能是必须的；⑥ATP依赖性：RNAi是一个ATP依赖的过程,需要ATP提供能量。MHCC97是利用裸鼠人肝癌高转移模型（LCI-D20）的皮下移植瘤组织在体外建立一株具有高转移潜能的人肝癌细胞系。该细胞经皮下和肝内接种均可使裸鼠致瘤,并发生肺部转移。MHCC97H是从MHCC97细胞系中分离出具有高转移潜能的单克隆细胞株,其自发肺转移率为100%。该细胞系是进行肝癌转移相关基因、蛋白研究及寻找特异性干预治疗靶点的良好模型。本研究拟应用RNA干扰技术将靶向EpCAM基因的siRNA瞬时转染肝癌离体细胞株MHCC97H,观察EpCAM基因表达沉默后对肝癌细胞株MHCC97H生物学特性的影响,初步探讨EpCAM基因在肝癌细胞增殖、凋亡、迁移中的作用。研究的目的在于给肝癌EpCAM基因治疗的可行性提供初步依据。方法设计靶向EpCAM基因的siRNA,瞬时转染肝癌离体细胞MHCC97H,观察EpCAM基因的表达情况。1. siRNA的设计应用siRNA设计软件初筛出9对siRNA,再通过BLAST分析剔除与其他编码基因有同源性的siRNA,最后经RNA结构分析软件分析将对应的基因序列位于二级结构的siRNA去掉,选出两条对靶向EpCAM的siRNA（包括EpCAM-siRNA-1078、EpCAM-siRNA-726）。2.瞬时转染肝癌MHCC97H细胞采用脂质体转染技术将EpCAM-siRNA转染MHCC97H细胞,转染48小时后进行相应检测。3.各项指标的检测用real-time PCR技术检测干扰后MHCC97H细胞的EpCAM表达量,然后用Western-blot检测干扰后EpCAM的蛋白表达水平,AnnexinⅤ-FITC/PI双染经流式细胞仪检测细胞凋亡率,Hoechst 33342/PI双染荧光显微镜观察细胞形态,MTT法检测细胞增殖情况,划痕实验检测细胞迁移情况。4.统计学方法应用SPSS13.0软件进行统计学处理,计量资料以均数±标准差（x（）±s）表示。MTT细胞增殖检测、细胞凋亡检测及细胞迁移实验均采用析因设计方差分析比较各组间差异；选取检验水准α=0.05。结果1. EpCAM mRNA表达的测定real-time PCR结果显示,MHCC97H细胞在转染设计的siRNA（包括EpCAM-siRNA-1078、EpCAM-siRNA-726） 48h后EpCAM表达均显著下降,与对照组相比,其差异具有统计学意义（P=0.000）。转染siRNA的MHCC97H细胞EpCAM表达水平为未转染的MHCC97H细胞的0.48±0.03和0.18±0.02,即EpCAM在EpCAM-siRNA-1078、EpCAM-siRNA-726两组细胞中的表达水平分别相当于它们在NS组表达水平的48%和18%（F=746.095,P=0.000）。2. EpCAM蛋白的表达的测定Western blot结果显示,EpCAM-siRNA-1078组、EpCAM-siRNA-726组、NC-siRNA-406组和NS组的EpCAM蛋白相对表达量分别为0.53±0.02、0.18±0.02、0.93±0.01和0.95±0.03,F=1117.86,P=0.000。3.细胞凋亡率的测定结果显示转染72小时后EpCAM-siRNA-1078组的细胞凋亡率为22.11±0.40%,EpCAM-siRNA-726组细胞凋亡率为23.93±0.26%,均显著高于未转染的MHCC97H组的细胞凋亡率（11.09±1.4%）（F=128.576,P=0.000）。转染后96小时后两干扰组与未转染组间虽然仍有统计学差异,但差异已变小（EpCAM-siRNA-1078组：26.78±0.68%,EpCAM-siRNA-726组：28.36±0.35%,NS组：24.55±1.29%,EpCAM-siRNA-406组：25.41±1.58;F=7.034,P=0.012）。4.细胞凋亡形态学观察Hoechst 33342/PI双染的转染EpCAM-siRNA-726组和转染EpCAM-siRNA-1078组细胞出现明显的变化（染色质凝聚,核皱缩,高蓝荧光的凋亡细胞）及细胞坏死（高红荧光）,转染NC-siRNA组可见少量细胞凋亡及坏死,而NS组细胞均未见明显荧光,说明绝大多数细胞未发生凋亡。5.细胞增殖的测定结果显示转染后48h和72h EpCAM-siRNA-1078组和EpCAM-siRNA-726组的活细胞数显著低于未转染组,以72h最为显著（EpCAM-siRNA-1078组：0.960±0.053,EpCAM-siRNA-726组：0.862±0.037,NS组：1.963±0.019,EpCAM-siRNA-406组：1.834±0.013；F=847.606,P=0.000）。6.细胞划痕实验检测EpCAM基因沉默后对肝癌细胞体外运动迁移能力的影响。实验结果显示：不同时间点迁移细胞数有显著性差异（F=801.379,P=0.000）; EpCAM-siRNA-1078组和EpCAM-siRNA-726组细胞迁移数显著低于NS组和NC-siRNA-406组,差异具有显著性（F=168.928,P=0.000）；不同细胞在不同时间迁移细胞数有显著性差异（F=15.149,P=0.000）。结论1.应用RNAi技术,将靶向EpCAM基因的siRNA转染肝癌细胞（MHCC97H）,能成功介导EpCAM基因沉默,达到靶向敲低EpCAM基因的目的。2.在MHCC97H细胞中敲低EpCAM基因的表达,MHCC97H细胞的凋亡率增高,增殖及迁移能力下降。3.瞬时转染靶向EpCAM基因的siRNA可以高效地敲低MHCC97H细胞的EpCAM基因表达,但发挥RNAi的时间较短,从结果分析,转染72h后, siRNA的干扰效率开始降低,并逐渐失效。