Toll样受体亚型单一和联合基因沉默稳定易损斑块的实验研究

论文摘要

背景动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是心脑血管疾病的病理基础。研究表明,伴有免疫反应的炎症过程贯穿于动脉粥样硬化的始终。炎性细胞如T淋巴细胞和巨噬细胞在动脉粥样硬化病变的进程中扮演了重要角色。血管内皮细胞、平滑肌细胞及外膜的成纤维细胞和肥大细胞均可作为免疫细胞产生炎性因子。但在动脉粥样硬化疾病的发生和发展中,其发病分子机制至今尚未阐明。近年来,Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）在炎症反应与天然（固有）和获得性（适应性）免疫反应中的作用日益受到人们的重视。Toll蛋白是最先在果蝇体内发现的一种信号转导蛋白,参与对细菌和真菌的识别及病原体的清除。随后.在哺乳动物体内发现的与Toll相似的跨膜蛋白被称为Toll样受体。TLRs能识别种类繁多的一病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）,属于模式识别受体。目前为止,人类TLR家族至少有11名成员已被发现。不同的PAMP活化人类TLR家族的不同成员。TLRs通过其跨膜结构将LPS信号传递入细胞内,级联式激活转导蛋白MyD88、白介素1受体激酶（IRAK）、肿瘤坏死因子6调节蛋白（TRAF6）和NF-κB诱导激酶（NIK）,进而激活核转录因子NF-κB,引起细胞因子的释放而导致炎症反应。启动炎症因子的释放,导致炎症反应的发生,在炎症反应的信号转导系统中发挥着极其重要的作用。AS的整个过程是炎症和免疫反应的过程,而TLRs能够介导天然性和获得性免疫反应,因此,TLRs与AS的关系正逐渐引起人们的重视。大量研究证实TLR1、TLR2、TLR4、TLR6等TLRs家族成员在AS的发生和发展过程中可能起到了重要作用,在人类和动物的AS斑块中已检测出上述TLRs的mRNA和蛋白质表达。已有的实验证实:动脉粥样硬化斑块表达TLR2和TLR4,这两种受体的表达量随病变的进展而增加,并且TLRs调控炎症和免疫反应、细胞凋亡、斑块稳定性以及血管重塑等AS病理过程。虽然近年来国内外学者在TLRs与AS斑块相互关系的研究中已取得较大的进展,但仍存在许多重大问题亟待解决:（1）既然TLR2和TLR4在AS形成和斑块破裂中扮演重要角色,能否通过封闭TLR2和TLR4基因表达阻止AS进程并降低AS斑块的易损性。这构成本课题的主导思想。（2）目前造成基因失活进行基因研究和基因治疗的方式主要基因沉默技术,又称RNA干扰（RNA interference,RNAi）,RNAi可以高效特异地阻断目标基因的表达,目前已经广泛地应用于体内和体外基因功能的研究中。哺乳动物细胞实验发现,化学合成的21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段（small interfering RNAs,siRNAs）,或是质粒或病毒载体介导的siRNA,均可引发基因沉默或者表达抑制。RNA干扰技术在细胞水平致病基因的功能研究中得到广泛应用。此外,通过高通量RNAi筛选,siRNA还被用于系统分析某些疾病的多种致病基因。借助于质粒或病毒载体的介导,siRNA已经被用于体内实验,特异性降低靶基因的表达。在进一步完善siRNA稳定性的基础上,RNAi的试剂有望应用于临床。（3）AS斑块中,TLR2和TLR4都发挥作用,那么这两者的各自作用及机制是什么?它们之间相的关系是独立的并联关系还是协同的网络联系?因此本课题开展了应用RNAi技术,单独或联合沉默LR2和TLR4基因,阻止AS进程,稳定易损斑块的研究。目的1.慢病毒表达载体的构建:根据TLR2和TLR4基因设计siRNA相应的DNA片段,分子克隆到BLOCK-It Lentiviral PolⅡmiR RNAi表达载体;2.动物实验研究TLR2i和LTR4i对于阻止AS进程,降低动脉粥样硬化斑块易损性的疗效;3.联合应该用TLR2i和LTR4i,对比研究联合干扰和单一干扰对动脉粥样硬化的稳定作用。方法1.RNA干扰慢病毒载体的构建以及有效靶点的筛选:1.1分别构建TLR2和TLR4基因的小分子干扰RNA载体的构建:设计、合成分别特异性针对小鼠TLR2和TLR4基因的小分子干扰RNA序列（各3段序列）,以BLOCK-It Lentiviral PolⅡmiR RNAi为母本,分别构建小分子干扰RNA载体BLOCK-TLR2-A、BLOCK-TLR2-B、BLOCK-TLR2-C、BLOCK-TLR4-A、BLOCK-TLR4-B、BLOCK-TLR4-C,DNA序列测定鉴定重组质粒的正确性。1.2慢病毒干扰载体的构建及体外扩增:将已构建好的上述6个穿梭质粒和对照载体BLOCK-mock,与携带CMV启动子的BLOCK-It Lentiviral PolⅡmiR表达载体进行rapid BP/LR重组,继而与293FT包装细胞结合形成病毒表达载体。1.3有效封闭TLR2和TLR4基因表达的RNA干扰慢病毒载体的筛选:将mock-LV、TLR2i-siteA、TLR2i-siteB、TLR2i-siteC、TLR4i-siteA、TLR4i-siteB、TLR4i-siteC的慢病毒载体转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞。荧光定量RT-PCR、Western blot分别检测各转染细胞TLR2和TLR4 mRNA水平、蛋白质水平的表达,筛选出有效阻断TLR2,TLR4表达的小分子干扰RNA载体。2.动物模型的建立:140只10-12周龄的雄性apoE-/-小鼠实验全程高脂饮食（含0.25%胆固醇和15%脂肪）喂养。全部实验鼠均于实验初行右颈总动脉套管（缩窄性硅胶管）术以诱发AS病变:0.08%戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠。颈部正中皮肤切开,剥离右侧颈部的腺体和肌肉,暴露右侧颈总动脉,小心分离与之伴行的迷走神经,固定右颈总动脉,将长度为3mm、内径为0.3mm的硅胶管（小鼠颈动脉血管直径为0.5mm）套置于血管的外周,固定套管。缝合皮肤切口,将小鼠放回笼中。3.RNA干扰慢病毒载体体内转染实验:颈动脉套管手术8周后,将10μL的LV-mock病毒悬液,10μL的LV-TLR2病毒悬液,10μL的LV-TLR4病毒悬液,5μL的LV-TLR2病毒悬液联合5μL的LV-TLR4病毒悬液,局部转染右颈动脉斑块,根据转染病毒不同,各组分别命名:空载体组（n=28）,TLR2干扰组（n=28）,TLR2干扰组（n=28）和TLR2+4联合干扰组（n=28）。另28只未转染病毒的小鼠归为对照组。我们将,TLR2干扰组,TLR4干扰组和TLR2+4联合干扰组统称为干扰组;对照组和空载体组称为非干扰组。病毒转染一周后和二周后空载体组分别处死3只动物,检测斑块内内GFP的表达。其余实验鼠于转染四周后处死,观察斑块内GFP的表达,检测斑块的病理学形态结构。4.血液生化指标检测:检测血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的水平。5.病理学检测:对颈动脉斑块分别进行H&E染色、油红O染色、天狼猩红染色,并通过免疫组织化学方法检测斑块内巨噬细胞（MOMA-2）、平滑肌肌动蛋白（α-actin）的表达。测量斑块面积和纤维帽的厚度,观察斑块的形态结构,检测斑块内胶原、脂质、巨噬细胞、血管平滑肌细胞的含量,计算易损指数:易损指数=（巨噬细胞+脂质）阳性面积百分比/（平滑肌细胞+胶原）阳性面积百分比。6.动脉斑块内部超微结构的检查:用2.5%戊二醛固定新鲜颈动脉斑块,脱水,浸透包埋,制作超薄切片,染色后投射电镜观察拍片。7.实时定量RT-PCR检测:取新鲜颈动脉斑块组织,提取RNA,实时荧光定量RT-PCR反应检测斑块内β-actin,TLR2,TLR4,IL-1β,IL-6,TNF-α和MCP-1 mRNA的表达水平。8.Western blot检测:取新鲜颈动脉斑块组织,提取蛋白质,Western blot检测斑块内β-actin,TLR2,TLR4。结果1.RNA干扰慢病毒载体的构建:制备编码携带小鼠TLR2和TLR4基因的BLOCK-It Lentiviral PolⅡmiR慢病毒载体,转染RAW264.7小鼠细胞进行筛选,病毒转染五天后收集细胞进行mRNA和蛋白水平的检测。结果表明TLR2i-siteA、TLR2i-siteB、TLR2i-siteC对基因TLR2 mRNA水平的沉默效果分别是56%,81%,和62%,蛋白水平的抑制效果分别是50%,62%,和35%,筛选出有效的克隆TLR2i-siteB;TLR4i-siteA、TLR4i-siteB、TLR4i-siteC对基因TLR2 mRNA水平的沉默效果分别是61%,54%,和72%,蛋白水平的抑制效果分别是45%,32%,和61%,筛选出有效的克隆TLR4i-siteC。2.慢病毒载体体内转染效率和基因沉默效率的检测:慢病毒载体转染一周后颈动脉AS斑块内可见绿色荧光蛋白GFP;转染二周后斑块内GFP的表达量增加;当实验结束,转染四周后斑块内仍可见GFP的表达。说明慢病毒载体有效的转入斑块内。TLR2mRNA水平分别下降50%和59%在TLR2干扰组和TLR2+4干扰组与对照组相比（P＜0.05）;TLR4干扰组的TLR2mRNA与对照组相比没有统计学差异;TLR2蛋白水平在TLR2干扰组和TLR2+4干扰组与其他组相比明显降低。TLR4mRNA水平分别下降48%和53%在TLR4干扰组和TLR2+4干扰组与对照组相比（P＜0.05）;TLR2干扰组的TLR4mRNA与对照组相比没有统计学差异;TLR4蛋白水平在TLR4干扰组和TLR2+4干扰组与其他组相比明显降低。3.血液生化指标检测:RNAi组和对照组血清TC、TG、HDL-C、LDL-C未见统计学差异。4.病理学检测:对照组,空载体组,TLR2干扰组,TLR4干扰组和TLR2+4联合干扰组的巨噬细胞含量百分比分别为31.8%,30.8%,26.9%,26.6%和18.6%;平滑肌细胞含量百分比分别为8.7%,8.7%,9.2%,10.5%和10.2%;斑块内脂质含量百分比分别为30.0%,29.2%,24.7%,24.9%和20.9%;斑块内胶原含量百分比分别为21.9%,23.2%,29.2%,29.0%和40%;纤维帽的厚度分别为9.96±0.97μm,10.03±1.38μm,16.97±4.2μm,15.41±1.2μm和17.29±0.72μm:易损指数分别为2.09±0.17,2.06±0.14,1.40±0.27,1.38±0.19和0.99±0.25。基因干扰各组与非干扰组相比,其巨噬细胞含量明显减少,脂质含量明显减低,胶原含量明显增加（P＜0.05）;在TLR2+4联合干扰组上述指标较TLR2,TLR4单独作用变化更为明显（P＜0.05）;析因分析显示,TLR2干扰,TLR4干扰对斑块内巨噬细胞数量和胶原含量的改变有协同作用。TLR4干扰在TLR4干扰组和TLR2+4联合干扰组与非干扰组相比可以增加平滑肌细胞含量,TLR2未见此作用。TLR2干扰和TLR4干扰可以增加斑块纤维帽的厚度（P＜0.05）,并且两者之间存在协同作用。干扰各组易损指数与非干扰组相比明显降低（P＜0.05）,且联合干扰组与TLR2,TLR4单独干扰组相比,降低更为明显（P＜0.05）。5.动脉斑块内部超微结构的检查:非干扰组电镜检查:内皮细胞胞质内有脂质颗粒,内皮连接结构疏松,基膜下有大小不等的脂质颗粒和泡沫细胞。斑块内可见大量泡沫细胞,胞质被大小不等的脂质颗粒占据。平滑肌细胞以合成型为多,合成型平滑肌细胞肌丝和密斑密体少,内质网、线粒体和脂质颗粒多。巨噬细胞内含大量颗粒和脂滴。斑块内可见破损溶解细胞,其中有大量脂质颗粒和钙化结晶。干扰组电镜检查:内皮细胞胞质内有少量脂质颗粒,内皮连接结构基本正常。平滑肌细胞合成型与收缩型均可见,细胞内可见脂质颗粒和各种细胞器,肌丝和密斑密体增多,粗面内质网及线粒体减少。泡沫细胞减少,细胞内及外基质中脂质颗粒明显减少。6.斑块内炎症因子的检测:TLR2干扰组的IL-6,MCP-1的mRNA水平与非干扰组相比显著降低（P＜0.05）;TLR4干扰组的IL-6,TNFα和MCP-1的mRNA水平与非干扰组相比显著降低（P＜0.05）;TLR2+4联合干扰组的IL-1β,IL-6,TNFα和MCP-1的mRNA水平与其余四组相比显著降低（P＜0.05）。析因分析显示,TLR2干扰和TLR4干扰对斑块内炎症因子的表达有协同作用。结论1.本研究成功地应用RNA干扰技术构建了针对小鼠TLR2和TLR4基因的慢病毒干扰载体。2.体内实验结果表明,TLR2和TLR4基因沉默能有效的抑制斑块局部TLR2和TLR4基因的表达,显著减少斑块内巨噬细胞的含量,降低斑块内炎症因子的表达,从而抑制斑块内炎症反应,增强斑块的稳定性。3.联合应用TLR2干扰和TLR4干扰,能够更有效的增加斑块的稳定性。TLR2和TLR4之间在动脉粥样硬化进程中相互之间存在着协同增强作用。背景动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是心脑血管疾病的病理基础。研究表明,伴有免疫反应的炎症过程贯穿于动脉粥样硬化的始终。炎性细胞如巨噬细胞和T淋巴细胞在动脉粥样硬化病变的进程中扮演了重要角色。血管内皮细胞、平滑肌细胞及外膜的成纤维细胞和肥大细胞均可作为免疫细胞产生炎性因子。但在动脉粥样硬化疾病的发生和发展中,其发病分子机制至今尚未阐明。近年来,Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）在炎症反应与天然（固有）和获得性（适应性）免疫反应中的作用日益受到人们的重视。Toll蛋白是最先在果蝇体内发现的一种信号转导蛋白,参与对细菌和真菌的识别及病原体的清除。随后,在哺乳动物体内发现的与Toll相似的跨膜蛋白被称为Toll样受体。TLRs能识别种类繁多的一病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）,属于模式识别受体。目前为止,人类TLR家族至少有11名成员已被发现。不同的PAMP活化人类TLR家族的不同成员。TLRs通过其跨膜结构将LPS信号传递入细胞内,级联式激活转导蛋白MyD88、白介素1受体激酶（IRAK）、肿瘤坏死因子6调节蛋白（TRAF6）和NF-κB诱导激酶（NIK）,进而激活核转录因子NF-κB,引起细胞因子的释放而导致炎症反应。启动炎症因子的释放,导致炎症反应的发生,在炎症反应的信号转导系统中发挥着极其重要的作用。AS的整个过程是炎症和免疫反应的过程,而TLRs能够介导天然性和获得性免疫反应,因此,TLRs与AS的关系正逐渐引起人们的重视。大量研究表明TLR1、TLR2、TLR4等TLRs家族成员在AS的发生和发展过程中可能起到了重要作用,在人类和动物的AS斑块中已检测出上述TLRs的mRNA和蛋白质表达。已有的实验证实:动脉粥样硬化斑块表达TLR2表达量随病变的进展而增加,并且TLRs调控炎症和免疫反应、细胞凋亡、斑块稳定性以及血管重塑等AS病理过程。TLR2必须与TLR家族中的其他成员,如TLR1,或者TLR6结合形成异源二聚体才能进行下游的信号传导过程。已有研究表明,在动脉粥样硬化斑块中,TLR1也同样有表达,尽管表达量较TLR2和TLR4含量偏少。既然TLR1和TLR2都在动脉粥样硬化斑块中表达,并且TLR2通过与其它TLR家族成员如TLR1形成异源二聚体然后进行下游的信号转导,我们不禁想探究TLR1和TLR2在易损斑块进展过程中的作用是什么?于是我们提出这样的假说:TLR1和TLR2可能在动脉粥样硬化易损斑块形成过程的作用不尽相同,应用基因沉默技术联合干扰TLR1和TLR2可能会较单一干扰TLR1或TLR2表达能更好的稳定易损斑块。因此本课题开展了应用RNAi技术,单独或联合沉默LR1和TLR2基因,阻止AS进程,稳定易损斑块的研究。目的1.慢病毒表达载体的构建:根据TLR1和TLR2基因设计siRNA相应的DNA片段,分子克隆到BLOCK-It Lentiviral PolⅡmiR RNAi表达载体;2.动物实验研究TLR1i和LTR2i对于阻止AS进程,降低动脉粥样硬化斑块易损性的疗效;3.联合应该用TLR1i和LTR2i,对比研究联合干扰和单一干扰对动脉粥样硬化的稳定作用。方法1.RNA干扰慢病毒载体的构建以及有效靶点的筛选:1.2分别构建TLR1和TLR2基因的小分子干扰RNA载体的构建:设计、合成分别特异性针对小鼠TLR1和TLR2基因的小分子干扰RNA序列（各3段序列）,以BLOCK-It Lentiviral PolⅡmiR RNAi为母本,分别构建小分子干扰RNA载体BLOCK-TLR1-A、BLOCK-TLR1-B、BLOCK-TLR1-C、BLOCK-TLR2-A、BLOCK-TLR2-B、BLOCK-TLR2-C,DNA序列测定鉴定重组质粒的正确性。1.2慢病毒干扰载体的构建及体外扩增:将已构建好的上述6个穿梭质粒和对照载体BLOCK-mock,与携带CMV启动子的BLOCK-It Lentiviral PolⅡmiR表达载体进行rapid BP/LR重组,继而与293FT包装细胞结合形成病毒表达载体。1.3有效封闭TLR1和TLR2基因表达的RNA干扰慢病毒载体的筛选:将mock-LV、TLR1i-siteA、TLR1i-siteB、TLR1i-siteC、TLR2i-siteA、TLR2i-siteB、TLR2i-siteC的慢病毒载体转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞。荧光定量RT-PCR、Western blot分别检测各转染细胞TLR1和TLR2 mRNA水平、蛋白质水平的表达,筛选出有效阻断TLR1,TLR2表达的小分子干扰RNA载体。2.动物模型的建立:140只10-12周龄的雄性apoE-/-小鼠实验全程高脂饮食（含0.25%胆固醇和15%脂肪）喂养。全部实验鼠均于实验初行右颈总动脉套管（缩窄性硅胶管）术以诱发AS病变:0.08%戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠。颈部正中皮肤切开,剥离右侧颈部的腺体和肌肉,暴露右侧颈总动脉,小心分离与之伴行的迷走神经,固定右颈总动脉,将长度为3mm、内径为0.3mm的硅胶管（小鼠颈动脉血管直径为0.5mm）套置于血管的外周,固定套管。缝合皮肤切口,将小鼠放回笼中。3.RNA干扰慢病毒载体体内转染实验:颈动脉套管手术8周后,将10μL的LV-mock病毒悬液,10μL的LV-TLR1病毒悬液,10μL的LV-TLR2病毒悬液,5μL的LV-TLR1病毒悬液联合5μL的LV-TLR2病毒悬液,局部转染右颈动脉斑块,根据转染病毒不同,各组分别命名:空载体组（n=28）,TLR1干扰组（n=28）,TLR2干扰组（n=28）和TLR1+2联合干扰组（n=28）。另28只未转染病毒的小鼠归为对照组。我们将,TLR1干扰组,TLR2干扰组和TLR1+2联合干扰组统称为干扰组;对照组和空载体组称为非干扰组。病毒转染一周后和二周后空载体组分别处死3只动物,检测斑块内内GFP的表达。其余实验鼠于转染四周后处死,观察斑块内GFP的表达,检测斑块的病理学形态结构。4.血液生化指标检测:检测血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的水平。5.病理学检测:对颈动脉斑块分别进行H&E染色、油红O染色、天狼猩红染色,并通过免疫组织化学方法检测斑块内巨噬细胞（MOMA-2）、平滑肌肌动蛋白（α-actin）的表达。测量斑块面积和纤维帽的厚度,观察斑块的形态结构,检测斑块内胶原、脂质、巨噬细胞、血管平滑肌细胞的含量,计算易损指数:易损指数=（巨噬细胞+脂质）阳性面积百分比/（平滑肌细胞+胶原）阳性面积百分比。6.实时定量RT-PCR检测:取新鲜颈动脉斑块组织,提取RNA,实时荧光定量RT-PCR反应检测斑块内β-actin,TLR1,TLR2,IL-6和MCP-1 mRNA的表达水平。7.Western blot检测:取新鲜颈动脉斑块组织,提取蛋白质,Western blot检测斑块内β-actin,TLR1,TLR2。结果1.RNA干扰慢病毒载体的构建:制备编码携带小鼠TLR1和TLR2基因的BLOCK-It Lentiviral PolⅡmiR慢病毒载体,转染RAW264.7小鼠细胞进行筛选,病毒转染五天后收集细胞进行mRNA和蛋白水平的检测。结果表明TLR1i-siteA、TLR1i-siteB、TLR1i-siteC对基因TLR1 mRNA水平的沉默效果分别是77%,44%,和63%,蛋白水平的抑制效果分别是70%,39%,和57%,筛选出有效的克隆TLR2i-siteA;TLR2i-siteA、TLR2i-siteB、TLR2i-siteC对基因TLR2 mRNA水平的沉默效果分别是56%,81%,和62%,蛋白水平的抑制效果分别是50%,62%,和35%,筛选出有效的克隆TLR2i-siteB。2.慢病毒载体体内转染效率和基因沉默效率的检测:慢病毒载体转染一周后颈动脉AS斑块内可见绿色荧光蛋白GFP;转染二周后斑块内GFP的表达量增加;当实验结束,转染四周后斑块内仍可见GFP的表达。说明慢病毒载体有效的转入斑块内。TLR1mRNA水平分别下降57%和48%在TLR1干扰组和TLR1+2干扰组与对照组相比（P＜0.05）;TLR2干扰组的TLR1mRNA与对照组相比没有统计学差异;TLR1蛋白水平在TLR1干扰组和TLR1+2干扰组与其他组相比明显降低。TLR2mRNA水平分别下降50%和59%在TLR2干扰组和TLR1+2干扰组与对照组相比（P＜0.05）;TLR1干扰组的TLR2mRNA与对照组相比没有统计学差异;TLR2蛋白水平在TLR2干扰组和TLR1+2干扰组与其他组相比明显降低。3.血液生化指标检测:RNAi组和对照组血清TC、TG、HDL-C、LDL-C未见统计学差异。4.病理学检测:对照组,空载体组,TLR1干扰组,TLR1干扰组和TLR1+2联合干扰组的巨噬细胞含量百分比分别为31.8%,30.8%,27.0%,26.9%和22.2%;平滑肌细胞含量百分比分别为8.7%,8.7%,8.5%,9.2%和10.2%;斑块内脂质含量百分比分别为30.0%,29.2%,28.4%,24.7%和21.9%;斑块内胶原含量百分比分别为21.9%,23.2%,23.4%,29.2%和29.4%;纤维帽的厚度分别为9.96±0.97μm,10.03±1.38μm,12.62±1.99μm,16.97±4.2μm和17.26±2.00μm;易损指数分别为2.09±0.17,2.06±0.14,1.94±0.20,1.40±0.27和1.22±0.15。基因干扰各组与非干扰组相比,其巨噬细胞含量明显减少（P＜0.05）;在TLR1+2联合干扰组上述指标较TLR1,TLR2单独作用变化更为明显（P＜0.05）。联合干扰组与非干扰组及TLR1单独干扰组相比,平滑肌细胞含量明显增加（P＜0.05）。TLR1干扰和TLR2干扰可以增加斑块纤维帽的厚度（P＜0.05）。TLR2干扰组易损指数与非干扰组相比明显降低（P＜0.05）,且联合干扰组与TLR1单独干扰组相比,降低更为明显（P＜0.05）。5.斑块内炎症因子的检测:TLR1干扰组的IL-6的mRNA水平与非干扰组相比显著降低（P＜0.05）:TLR2干扰组的和TLR1+2联合干扰组的IL-6和MCP-1的mRNA水平与其余三组相比显著降低（P＜0.05）。结论1.本研究成功地应用RNA干扰技术构建了针对小鼠TLR1和TLR2基因的慢病毒干扰载体。2.体内实验结果表明,TLR1和TLR2基因沉默能有效的抑制斑块局部TLR1和TLR2基因的表达,显著减少斑块内巨噬细胞的含量,降低斑块内炎症因子的表达,从而抑制斑块内炎症反应,增强斑块的稳定性。3.联合应用TLR1干扰和TLR2干扰,能够更有效的增加斑块的稳定性。

论文目录

• 中文摘要Ⅰ
• 英文摘要Ⅰ
• 符号说明Ⅰ
• 论文Ⅰ
• 前言
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 4.结论
• 附表Ⅰ
• 附图Ⅰ
• 参考文献Ⅰ
• 中文摘要Ⅱ
• 英文摘要Ⅱ
• 论文Ⅱ
• 前言
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 4.结论
• 附表Ⅱ
• 附图Ⅱ
• 参考文献Ⅱ
• SCI论文Ⅰ
• SCI论文Ⅱ
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表SCI文章
• 学位论文评阅及答辩情况表