adh2缺失型纤维乙醇工程菌菌株构建研究

论文摘要

本文从嗜鞣管囊酵母P-01（Pachysolen tannophilus）出发,利用wood氏法测定了在发酵过程中乙醇脱氢酶（ADHⅡ）Ⅱ酶活,结果表明:发酵过程中P-01的ADHⅡ酶活性明显高于对照菌株南阳酒精酵母1308（Saccharomyces cerevisiae）。通过对NCBI中存在的Saccharomyces kluyveri、Pichia stipitis alcohol、Candida albicans SC5314、Saccharomyces cerevisiae四个菌株所具有的乙醇脱氢酶Ⅱ基因（adh2）进行同源性分析比对,设计同源性引物,克隆嗜鞣管囊酵母P-01的adh2。通过聚合酶链式反应（PCR）克隆得到了一段长为340bp的片段,同源性分析表明:其为嗜鞣管囊酵母P-01的adh2部分片段。利用RACE法克隆得到了嗜鞣管囊酵母P-01的adh2。并向NCBI注册了序列,序列号分别为EU570211,EU590042。采用基因敲除技术定向敲除嗜鞣管囊酵母P-01的adh2,重组子通过PCR、全糖发酵等试验进行筛选,最后得到两株能够同时发酵木糖和葡萄糖、比较优良、adh2缺失的菌株MC和ND。发酵结束时乙醇度分别达到2.0%（v/v）、2.4 %（v/v）,原菌P-01 1.85%（v/v）,ND、MC发酵产乙醇性能比P-01提高了5.2%和19.4%,乙醇产率达到理论值的74.5%和85.1%。最后对重组子ND、MC在玉米秸秆水解液中的发酵性能进行了研究。ND、MC发酵玉米秸秆水解液乙醇浓度达到1.25%（v/v）、1.15%（v/v）,高于亲株P-01 0.95%（v/v）,P-01、ND、MC乙醇产率为43.9%、57.8%、53.2%,MC、ND发酵产乙醇性能比P-01提高了9.3%和13.9%。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 第一章 文献综述
• 1 能源状况
• 2 纤维燃料乙醇
• 3 基因敲除技术概述
• 3.1 基因敲除技术的概念
• 3.2 基因敲除的原理和方法
• 3.2.1 利用基因同源重组进行基因敲除
• 3.2.2 条件性敲除
• 3.2.3 利用随机插入突变进行基因敲除
• 3.2.4 基因捕获法
• 3.2.5 RNAi 引起的基因敲除
• 3.2.5.1 RNAi 阻断基因表达的机理
• 3.2.5.2 RNAi 基因敲除的优点及应用
• 3.2.6 实现基因敲除的其他原理
• 3.3 基因敲除技术的应用及前景
• 3.3.1 改造生物、培育新的生物品种
• 3.3.2 建立生物模型
• 3.3.3 疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗
• 3.3.4 提供廉价的异种移植器官
• 3.3.5 免疫学中的应用
• 3.4 基因敲除技术的缺陷
• 4 嗜鞣管囊酵母P-01 的性能
• 5 本课题的目的意义
• 6 本课题研究的内容及技术路线
• 第二章 嗜鞣管囊酵母P-01 乙醇脱氢酶Ⅱ活性测定及其对乙醇发酵的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 菌种活化
• 1.2.2 发酵
• 1.2.3 酶活性测定
• 2 结果与分析
• 2.1 酶活分析
• 2.2 酸度与pH 值分析
• 3 本章小结
• 第三章 嗜鞣管囊酵母P-01 乙醇脱氢酶Ⅱ基因克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 PCR 引物
• 1.1.3 试剂及试剂盒
• 1.1.4 培养基及缓冲溶液
• 1.1.5 主要仪器设备
• 1.1.6 数据库及软件
• 1.2 方法
• 1.2.1 酵母基因组DNA 的提取
• 1.2.2 RNA 的提取
• 1.2.3 同源性分析及设计引物
• 1.2.4 PCR 反应
• 1.2.5 PCR 产物检测、纯化、测序
• 2 结果与分析
• 2.1 嗜鞣管囊酵母P-01，南阳酒精酵母1308 基因组DNA
• 2.2 嗜鞣管囊酵母P-01RNA
• 2.3 乙醇脱氢酶Ⅱ基因克隆
• 2.4 乙醇脱氢酶Ⅱ基因克隆测序结果分析
• 2.5 3′Race 结果
• 2.6 5′RACE 结果
• 2.7 全长基因的克隆
• 2.8 同源性分析
• 3 本章小结
• 第四章 嗜鞣管囊酵母P-01 乙醇脱氢酶Ⅱ基因的敲除
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试菌株及质粒
• 1.1.2 PCR 引物（5′至3′）
• 1.2 方法
• 1.2.1 嗜鞣管囊酵母P01 生长曲线的测定
• 1.2.2 SFH-PCR（short flanking homology PCR）
• 1.2.2.1 抗性基因的克隆与回收
• 1.2.2.2 醋酸锂转化
• 1.2.3 嗜鞣管囊酵母P01 G418 最低耐受性试验
• 1.2.4 重组子的PCR 验证试验
• 1.2.4.1 重组子基因组DNA 的提取
• 1.2.4.2 PCR 产物验证
• 1.2.4.3 纯合体的验证
• 1.2.5 纯糖发酵试验
• 1.2.6 纤维糖化液发酵试验
• 1.2.6.1 纤维质原料的预处理
• 1.2.6.2 纤维质原料的酶解糖化
• 1.2.6.3 总还原糖含量测定
• 1.2.6.4 ND、MC 发酵玉米秸秆
• 2 结果与分析
• 2.1 嗜鞣管囊酵母P-01 生长曲线
• 2.2 嗜鞣管囊酵母P-01 对G418 的最低耐受性
• 2.3 重组子的验证实验
• 2.3.1 重组子抗性筛选
• 2.3.2 PCR 产物验证
• 2.3.3 部分重组子的全糖发酵结果
• 2.4 重组子ND、MC 的验证实验
• 2.4.1 重组子ND、MC 的乙醇脱氢酶Ⅱ活性测定
• 2.4.2 PCR 产物单酶切和测序验证
• 2.4.3 重组子ND、MC 的遗传稳定性试验
• 2.4.4 ND、MC 的发酵结果
• 3 本章小结
• 第五章 结论与讨论
• 1 结论
• 2 讨论
• 2.1 DNA 提取方法
• 2.2 基因敲除的完整性
• 2.3 重组子酒精产率提高的进一步验证
• 2.4 全糖发酵重组子的基础性研究
• 2.5 MC、ND 的进一步改造建议
• 2.6 adh2 的后续研究
• 参考文献
• Abstract