人参皂甙Rd抑制大鼠脑缺血后炎性反应的机制研究

论文摘要

缺血性脑血管疾病又称脑卒中,因其致病机制复杂,影响范围广泛,已经成为世界第二大致死病因,临床上鲜有明确的神经保护药物出现。人参和三七是我国应用广泛的传统药物,上千年的用药史已证实其有效性和安全性。作为两种药物的主要有效活性成分之一,人参皂甙（Ginsenosides, GS）已被证实可以减少脑缺血再灌后的脑梗死体积,保护海马锥体神经元。确定人参皂甙的有效单体成分及其作用机理,是开发一种新型脑保护药物的首要任务。人参皂甙Rd （Ginsenoside Rd, GSRd）作为人参皂甙的主要活性成分之一,具有抵抗惊厥、延缓衰老、调节免疫等多种药理作用。我们的前期研究表明,GSRd可以通过抑制过氧化氢的毒性损伤作用以保护PC12细胞;抑制氧糖剥离模型造成的氧化应激损伤;抑制神经元胞内钙超载,抵抗谷氨酸兴奋性毒性损伤。临床试验结果同样证实对急性缺血性脑卒中患者GSRd治疗有效。这些研究结果均表明GSRd具有明显的神经保护作用,但其作用机理尚未完全清楚。研究表明炎性反应是脑缺血再灌注损伤中的一个重要环节,涉及多种免疫细胞及免疫因子,因此通过抑制炎性反应和细胞因子的产生来减少缺血损伤成为脑保护研究的新方向。脑缺血后小胶质细胞（microglia,MG）一方面可以作为抗原提呈细胞,介导受损区域的炎性反应;另一方面又可以分泌多种物质以调节炎性反应。GSRd是否会通过影响中枢神经系统的MG的状态和功能来发挥神经保护作用,目前尚无定论。本实验首先观察炎性反应中GSRd对MG的影响,然后逐步深入研究GSRd对由MG分泌的多种细胞因子的作用,初步探讨脑缺血后GSRd发挥抗炎作用的机制。实验一GSRd对大鼠脑缺血再灌注损伤后MG的影响目的:研究GSRd对大鼠脑缺血再灌注损伤后MG及其分泌多种细胞因子的影响。方法:采用大鼠大脑中动脉阻塞再通模型模拟脑缺血再灌注损伤,分别在再灌后12小时、1天、3天和7天四个时间点,使用免疫组织化学染色方法观察MG在使用GSRd（10mg/Kg）后形态和数量的变化。使用半定量PCR检测脑缺血后GSRd（10mg/Kg）对NF-κB mRNA水平变化的影响。使用液相芯片技术检测脑缺血后和使用GSRd（10mg/Kg）后各个时间点IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-ɑ、IFN-γ、CXCL1、TGF-β蛋白水平变化。结果:免疫组织化学染色结果显示,脑缺血再灌注损伤后,MG显著激活,数量增多,形态上迅速由分枝状静息状态转变为活化状态,且其活化程度具有时间依赖性,在第7天达到高峰;使用GSRd预处理后,各个时间点MG数量明显减少,活化细胞体积变小。液相芯片技术检测结果表明脑缺血后IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-ɑ、IFN-γ、CXCL1的蛋白含量明显逐渐增加,第三天达到高峰,TGF-β含量有所增加;使用GSRd预处理后,IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-ɑ、IFN-γ、CXCL1的RNA和蛋白含量明显减少,TGF-β含量明显增加。半定量PCR显示NF-κB mRNA同趋势变化。结论:GSRd可以减少MG的活化数量,抑制MG分泌IL-18、TNF-ɑ,增加TGF-β含量,抵抗脑缺血再灌后的炎症损伤。提示GSRd抑制细胞因子的生成,减轻炎性反应可能是其发挥神经保护作用的机理之一。实验二人参皂甙Rd对原代培养MG的影响目的:观察GSRd对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）激活的原代培养MG及其并其分泌多种细胞因子的影响。方法:原代方法培养新生大鼠MG。免疫荧光染色鉴定MG纯度。体外培养至12天进行实验。使用LPS激活MG,观察使用10μM GSRd预处理后MG形态和数量的变化;使用液相芯片技术检测LPS激活后和使用10μM GSRd预处理后细胞上清中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-ɑ、IFN-γ、CXCL1蛋白水平变化。结果:正常细胞和10μM GSRd对照组之间无明显差异;给予LPS激活MG后,MG形态上能够从杆状转化为阿米巴样,而活化细胞数量明显增加;而使用10μM GSRd预处理后,阿米巴样MG数量减少,细胞体积变小。液相芯片技术检测结果也表明正常细胞和10μM GSRd对照组之间无明显差异,LPS激活后IL-1β、TNF-ɑ、IL-6、IL-18、IFN-γ、CXCL1含量明显增加,使用10μM GSRd预处理后,这些细胞因子含量明显减低,但又高于对照组,差异有统计学意义。结论:GSRd能够减少LPS激活的MG数量和体积,抑制MG分泌IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-ɑ、IFN-γ、CXCL1,提示GSRd可以通过抑制细胞因子的分泌影响MG的形态和功能,减轻炎性反应,具有神经保护作用。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献回顾
• 一、缺血性脑卒中
• 1. 脑卒中的危险因素
• 2. 脑卒中的治疗策略
• 3. 脑卒中可能的损伤机制
• 3.1 氧化应激与硝化应激
• 3.2 皮层去极化扩散
• 3.3 兴奋性毒性损伤
• 3.4 钙调节障碍
• 3.5 凋亡、坏死和自噬
• 3.6 炎症
• 二、炎症和小胶质细胞
• 1. 缺血/再灌注后的炎症免疫反应
• 2. MG
• 2.1 MG 的起源
• 2.2 MG 的形态
• 2.3 MG 的功能
• 2.4 MG 和脑缺血损伤的关系
• 2.5 MG 的活化机制
• 3. 炎性介质
• 3.1 IL-1
• 3.2 TNF-α
• 3.3 IL-6
• 3.4 IL-18
• 3.5 IFN-γ
• 3.6 TGF-β1
• 3.7 CXCL1
• 三、人参皂甙Rd
• 四、LUMINEX 液相芯片技术
• 实验一 GSRd 对大鼠脑缺血再灌注损伤后MG 的影响
• 引言
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 实验动物
• 2 方法
• 2.1 动物分组和模型制作
• 2.2 TTC 染色和神经功能学评分
• 2.3 免疫组织化学染色观察MG 的变化
• 2.4 检测脑缺血再灌住后MG 释放细胞因子蛋白表达变化
• 2.5 检测脑缺血再灌住后NF-κB mRNA 表达变化
• 2.6 统计学分析
• 3 结果
• 3.1 GSRd 对大鼠MCAO 模型脑梗死体积和神经功能学评分的影响
• 3.2 GSRd 对MCAO 模型后激活MG 形态的影响
• 3.3 GSRd 对MCAO 模型后激活MG 功能的影响
• 3.4 GSRd 对MCAO 模型后NF-κB mRNA 的影响
• 4 讨论
• 实验二 GSRd 对原代培养MG 的影响
• 引言
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 实验动物
• 2 方法
• 2.1 原代培养大鼠MG
• 2.2 免疫荧光染色法鉴定MG 纯度
• 2.3 免疫荧光染色法观察MG 形态
• 2.4 Luminex technology 检测细胞因子
• 2.5 统计学分析
• 3 结果
• 3.1 原代培养的MG 的形态和纯度
• 3.2 GSRd 对LPS 激活MG 形态的影响
• 3.3 GSRd 对LPS 激活MG 功能的影响
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢