含cry1Ab和cry2Ab双基因的抗虫转基因水稻的研究

论文摘要

苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是一类非常重要的杀虫微生物,它能产生杀虫结晶蛋白,对农业上的许多有害昆虫有特异性的毒杀作用。近三十年来,以苏云金杆菌杀虫蛋白为基础的转基因植物已在世界范围内商业化,用于防治重要经济作物的害虫。随着抗虫转基因植物的广泛应用,使得害虫连续暴露在Bt毒蛋白的选择压力下,害虫对Bt杀虫蛋白质抗性的发生不可避免。部分害虫已经产生了Bt抗性,影响了Bt转基因农作物的功效。同时使用两个以上杀虫机理有差别的Bt毒蛋白基因转化植物,可以防止或延缓害虫抗性的发生,同时也可以扩大转基因植物的抗虫谱和抗虫效果。CrylAb蛋白与Cry2Ab蛋白的氨基酸序列同源性非常低,研究表明它们不易产生交互抗性。因此本论文构建了同时包括抗虫基因crylAb表达框、抗虫基因cry2Ab表达框和草甘膦抗性基因1174表达框的T-DNA转化载体1300-crylAb-cry2Ab-1174。以携带该载体的农杆菌LBA4404侵染粳稻“秀水110”,获得了双抗虫基因同时抗草甘膦的转基因水稻。对获得的转基因水稻进行PCR鉴定和Southern杂交试验,结果显示,抗虫基因已成功地转入到水稻中；Western Blot分析表明抗虫基因cry1Ab、cry2Ab和草甘膦抗性基因1174均在转基因水稻叶片中成功获得表达。利用棉铃虫和稻纵卷叶螟对转基因水稻进行抗虫生物测定,结果显示该转基因水稻具有良好的抗虫性能；通过喷施20mM/L的草甘膦,发现该转基因水稻对草甘膦具有很好的抗性。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 1. 文献综述
• 1.1 苏云金杆菌研究进展
• 1.1.1 苏云金杆菌的基本特性
• 1.1.2 苏云金杆菌杀虫晶体蛋白
• 1.1.3 苏云金杆菌杀虫蛋白基因的分类
• 1.1.4 苏云金杆菌的杀虫机理
• 1.2 害虫对转BT作物抗性的产生及其延缓策略
• 1.2.1 害虫对转BT作物抗性的产生
• 1.2.2 延缓害虫对转Bt基因植物产生抗性的策略
• 1.2.2.1 基因聚合策略
• 1.2.2.2 "高剂量-庇护所"策略
• 1.2.2.3 提高转基因植物Bt杀虫晶体蛋白的表达量
• 1.3 转基因抗虫水稻的研究进展
• 1.4 抗除草剂转基因水稻
• 1.4.1 草甘膦作用机理
• 1.4.2 EPSPS合成酶编码基因的研究进展
• 1.4.3 抗除草剂转基因植物的培育策略
• 1.4.4 EPSPS酶编码基因在作物遗传育种上的应用
• 1.5 转基因植物的商品化
• 1.6 研究目的与意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株与载体
• 2.1.3 试剂与仪器
• 2.1.4 主要培养基及溶液
• 2.2 方法
• 2.2.1 分子生物学实验方法
• 2.2.1.1 PCR反应
• 2.2.1.2 大肠杆菌质粒提取
• 2.2.1.3 酶切反应
• 2.2.1.4 凝胶回收
• 2.2.1.5 连接反应
• 2.2.1.6 大肠杆菌TG1感受态细胞的制备及转化
• 2.2.1.7 农杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.2.1.8 农杆菌转化克隆鉴定
• 2.2.2 水稻转化表达载体的构建
• 2.2.3 农杆菌介导的外源基因的水稻转化
• 2.2.3.1 水稻成熟胚愈伤组织的诱导
• 2.2.3.2 农杆菌与水稻愈伤的共培养
• 2.2.3.3 抗性愈伤组织的筛选
• 2.2.3.4 转化植株的再生与培养
• 2.2.4 转基因水稻的PCR鉴定
• 2.2.4.1 植物总DNA的提取（CTAB法）
• 2.2.4.2 PCR鉴定
• 2.2.5 转基因水稻的Western Blot分析
• 2.2.5.1 TRIzol法提取植物组织蛋白质
• 2.2.6 Southern blot分析
• 2.2.6.1 水稻基因组DNA的提取
• 2.2.6.2 酶切及电泳
• 2.2.6.3 转膜（高盐转膜法）
• 2.2.6.4 杂交（选用DIGI-Ⅱ型试剂盒）
• 2.2.6.5 洗膜
• 2.2.7 生物测定
• 2.2.8 转基因水稻抗草甘膦检测
• 3 结果与分析
• 3.1 转基因水稻植株的获得
• 3.2 转基因水稻的鉴定
• 3.2.1 转基因水稻的PCR鉴定
• 3.2.2 转基因水稻Western杂交分析
• 3.2.3 转基因水稻Southern杂交分析
• 3.2.4 转基因水稻的生物测定
• 3.2.5 转基因植株草甘膦抗性检测
• 4. 小结与讨论
• 参考文献
• 作者简历