CyPA在重症急性胰腺炎中的作用及机制研究

论文摘要

研究背景急性胰腺炎（AP）是一种潜在致死性疾病,临床上多为自限性轻型急性胰腺炎（MAP）,但仍有20%的患者可发展为重症急性胰腺炎（SAP）,死亡率可高达10～30%,是普通外科比较常见的凶险急腹症。近年来SAP的发病率有所上升,易早期并发器官功能衰竭（MOF）。目前认为,SAP发病过程中,白细胞尤其是中性粒细胞（PMN）的过度激活发挥十分关键的作用。运用抗PMN抗体或抗PMN血清消耗外周血PMN后,能明显减轻SAP组织损伤。研究认为SAP中,PMN致病过程多由有趋化功能的细胞因子所介导。细胞外亲环素A（CyPA）正是一种新近发现的极其重要的PMN趋化因子,CD147为其传递信号途径的膜受体。脓毒症及一些炎症疾病中,血清CyPA表达水半明显增加,与疾病的严重程度或疾病的活动性呈正相关。文献报道,CyPA与效应细胞表面的CD147相瓦作用,调控炎症反应的发生和发展。但是,国内外尚尢研究阐明CyPA在SAP发生发展中的作用。目的本研究旨在探讨SAP中血清CyPA表达的意义,分析其与组织损伤及PMN浸润的关系,血清CyPA的测定在评估AP严重程度及预后中的意义,并进一步研究SAP中CyPA调控PMN凋亡延迟的可能机制,为临床上更有效地治疗SAP提供新的理论依据。全文分三部分:第一部分,主要探讨人鼠SAP中血清CyPA的表达,分析血清CyPA表达与疾病严重程度及PMN浸润的相关性;第二部分,从临床着手,探讨血清CyPA的测定在AP严重程度及预后评估中的意义;第三部分,探讨SAP中,CyPA调控PMN凋亡延迟的可能机制。方法第一部分健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠54只,体重200～250g,随机分成三组:正常对照组（NC组）:开腹后轻轻翻动十二指肠和胰腺,关腹;MAP组:以0.5%牛磺胆酸钠（1.0mL/kg）逆行胰胆管注射,诱导MAP模型;SAP组:以5%牛磺胆酸钠（1.0mL/kg）逆行胰胆管注射,诱导SAP模型。各组分别于术后3h、6h、12h处死大鼠,收集血清、胰腺和肺组织标本。测定血清淀粉酶（AMS）活性;EHSA法测定血清CVPA水平;制作胰腺和肺组织标本,HE染色用于胰腺和肺组织损伤的病理学评估;分光光度计测定胰腺和肺组织中髓过氧化酶（MPO）活性,分析CyPA与疾病严重程度及PMN浸润的相关性。第二部分2006年12月至2008年4月住院诊断为AP的69例患者（MAP 41名,SAP 28名）及健康志愿者30名被列入此次研究。发病48h内抽取患者静脉血,ELISA法检测血清CyPA水平,发病72h抽取患者静脉血测定C反应蛋白(CRP-72h),收集病人的病历资料（CT、APACHⅡ评分、有无器官衰竭等）。按照AP的严重程度、是否并发器官功能衰竭、是否发生胰腺坏死将患者分组,检验组间的血清CyPA水平差异,分析血清CyPA水平在评估AP疾病严重程度及预后的意义。第三部分2006年12月至2008年4月住院诊断为AP的30例患者（MAP及SAP组各15例）及15名健康志愿者被列入此次研究。发病48h内抽取患者静脉血,流式技术检测外周血PMN表面CD147表达;分离外周血PMN,流式技术测定其凋亡情况,RT-PCR及Western Blot法检测XIAP表达;原代培养PMN 6h,用人源重组CyPA、CD147抗体（CD147mAb）及环孢素A（CsA）干预PMN,RT-PCR及Western Blot法检测XIAP表达变化,探讨CyPA调控PMN凋亡延迟的可能机制。结果第一部分1.与NC组比较,MAP、SAP组各时间点（3h、6h、12h）血清AMS活性均显著升高,胰腺损伤（水肿、出血、坏死和炎症）病理学评分均显著增加（P<0.001）;与MAP组比较,SAP组各时间点（3h、6h、12h）血清AMS活性、胰腺损伤（水肿、出血、坏死和炎症）病理学评分均增加更显著（P<0.001）。因此,我们采用不同浓度的牛磺胆酸钠逆行胰胆管注射成功地建立了SAP及MAP大鼠模型。2.与NC、MAP组比较,SAP组各时间点（3h、6h、12h）血清CyPA表达水平均显著升高（P<0.001）;各时间点血清CyPA水平与胰腺损伤的严重程度正相关（3h:r=0.793,P<0.001;6h:r=0.845,P<0.001;12h:r=0.856.P<0.001）。3.SAP组胰腺及肺组织中大量PMN浸润,MPO活性明显升高,与NC组、MAP组比较,SAP组各时间点（3h、6h、12h）胰腺及肺组织MPO活性显著增加（P<0.001）。血清CyPA水平胰腺及分组织MPO活性呈正相关（胰腺:3h r=0.860,P<0.001,6h r=0.899,P<0.001,12h r=0.919,P<0.001;肺:3h r=0.554,P=0.017,6h r=0.711,P<0.001,12h r=0.878,P<0.001）。第二部分1.与NC、MAP组比较,SAP组血清CyPA及CRP-72h水平均升高（P<0.001）,SAP组较MAP组升高史显著（P<0.001）。血清CyPA与CRP-72h变化一致,两者之间有相关性（r=0.754,P<0.001）。2.与无器官功能衰竭组比较,器官衰竭组血清CyPA水半更高,两者之间有显著差异（P<0.001）。与无胰腺坏死组比较,胰腺坏死组血清CyPA水平高,两者之间有显著差异（P<0.001）。3.与血清CRP-72h比较,血清CyPA能更好的评估AP的严重程度及预后。第三部分1.SAP组外周血PMN凋亡延迟,与NC、MAP组比较,有显著差异（P<0.001）。SAP组外周血PMN XIAP mRNA及蛋白表达水平增加,与NC组、MAP组比较,有显著差异（P<0.001）。2.NC、MAP及SAP组外周血PMN均有CD147表达,SAP组较NC、MAP组外周血PMN CD147表达显著增强（P<0.001）,SAP组较MAP组升高更显著（P<0.001）,说明SAP组外周血PMN的炎性活性更高。3.不同浓度CyPA作用正常人外周血PMN 6h,其凋亡随CyPA浓度增加呈双相变化。当CyPA浓度≤200ng/mL时,CyPA抑制PMN凋亡,CyPA对PMN凋亡的抑制作用随浓度增加而增加,当浓度>200ng/mL时,CyPA对PMN凋亡的抑制作用随浓度增加而减弱。PMN表达XIAP mRNA及蛋白水平变化同凋亡变化一致。5.以200ng/mL CyPA作用NC、MAP及SAP组外周血PMN 6h,各组外周血PMN XIAP mRNA及蛋白水平均增加,SAP组较NC、MAP组增加更显著（P<0.001）。SAP组外周血PMN炎性活性更高。6.CsA及抗CD147mAb,能够阻断CyPA（200ng/mL）上调外周血PMN XIAP mRNA及蛋白的表达,推测CyPA与PMN表面CD147相互作用,通过增加PMN XIAP表达,抑制其凋亡。结论我们的研究显示SAP中血清CyPA表达增加,可作为评估AP严重程度及预后的早期指标;同时发现SAP中,CyPA-CD147相互作用介导PMN组织浸润,增加PMN XIAP表达,抑制PMN凋亡,调控炎症的发生发展。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 目录
• 缩略词
• 第一部分 大鼠重症急性胰腺炎血清CyPA表达的意义
• 1.前言
• 2.技术路线
• 3.材料与方法
• 4.结果
• 5.讨论
• 6.结论
• 第二部分 血清CyPA测定在评估急性胰腺炎严重程度及预后中的意义
• 1.前言
• 2.技术路线
• 3.材料与方法
• 4.结果
• 5.讨论
• 6.结论
• 第三部分 CyPA调控中性粒细胞凋亡延迟在重症急性胰腺炎中的机制研究
• 1.前言
• 2.技术路线
• 3.材料与方法
• 4.结果
• 5.讨论
• 6.结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间的研究成果