利用基因工程技术提高青蒿中青蒿素含量的研究

论文摘要

青蒿素是从青蒿（Artemisia annua L.）植株的地上部分提取的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯,是目前最有效的治疗疟疾的药物。由于人工合成青蒿素的难度大,目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取。而青蒿中青蒿素的含量很低（约0.01%-1%）,使得青蒿素的市场供应能力受到了限制。因此,利用代谢工程提高青蒿素的产量具有重要意义。为了提高青蒿素的产量,本研究从两个方面进行:一是利用转基因技术,在转基因青蒿中过量表达青蒿素生物合成途径中的关键酶基因。二是利用植物激素ABA来处理青蒿植株。同时,为了深入研究cyp71av1基因的表达调控,本研究对它的启动子进行了克隆,并进行了初步的分析。本研究得到了如下结果:（1）构建了青蒿素生物合成途径中关键基因的表达载体。（2）采用农杆菌介导法转化青蒿叶片,获得了系列的转基因青蒿,包括25株转fps基因的青蒿、43株转ads基因的青蒿、10株共转fps和ads基因的青蒿、38株共转hmgr和fps基因的青蒿以及20株共转cyp71av1和cpr基因的青蒿。（3） Southern blot分析结果表明外源DNA整合到青蒿基因组中。（4）用HPLC-ELSD测定了转基因青蒿中青蒿素的含量,从转不同基因的青蒿中均筛选出了青蒿素含量显著提高的转基因青蒿株系。其中,转ads基因、转fps基因、共转ads和fps基因、共转hmgr和fps基因以及共转cyp71av1和cpr基因的青蒿中,青蒿素含量最高的株系中青蒿素含量分别为对照的1.8、2.2、2.0、1.8和2.4倍。（5）用三种不同浓度ABA溶液（1μM、10μM、100μM）处理青蒿植株,使得青蒿素的含量显著的提高。其中10μM ABA溶液的效果最好,能够使青蒿素的含量提高65%。（6）用10μM ABA处理青蒿植株和悬浮细胞,研究了青蒿素生物合成途径中关键基因表达的变化情况,发现hmgr、fps、cyp71av1和cpr基因的表达受ABA诱导。（7）克隆了cyp71av1基因的启动子,序列分析结果表明,TATA box位于-25到-30 nt的位置,CAAT box位于-53到-57 nt的位置。（8）采用5’-RACE技术确定cyp71av1基因的转录起始位点,发现其位于起始密码子ATG上游18 bp的地方,该碱基为A。（9）构建了一系列5’端缺失启动子与gus基因融合的表达载体,可用于启动子上顺式作用元件的分析。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写词表
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 青蒿简介
• 1.3 青蒿素的生物合成途径
• 1.4 青蒿素代谢调控的研究
• 1.4.1 青蒿素生物合成途径中的关键基因
• 1.4.2 青蒿素的含量与环境因子的关系
• 1.5 应用生物技术生产青蒿素
• 1.5.1 细胞与组织培养
• 1.5.2 利用基因工程提高青蒿中青蒿素的含量
• 1.5.3 利用微生物生产青蒿素
• 1.6 结论和展望
• 1.7 本研究的目的和意义
• 第二章 过量表达青蒿素合成关键基因提高青蒿素含量
• 2.1 引言
• 2.2 材料与试剂
• 2.2.1 植物材料
• 2.2.2 菌株
• 2.2.3 常用质粒载体
• 2.2.4 酶与试剂盒
• 2.2.5 常用试剂
• 2.2.6 常用试剂及培养基的制备
• 2.3 方法
• 2.3.1 青蒿无菌苗培养
• 2.3.2 青蒿素合成途径关键酶编码基因的克隆
• 2.3.3 植物表达载体的构建
• 2.3.4 青蒿叶片的遗传转化
• 2.3.5 转基因青蒿的分子检测
• 2.3.6 转基因青蒿中青蒿素含量的检测
• 2.4 结果
• 2.4.1 青蒿素生物合成途径中关键基因的克隆
• 2.4.2 植物表达载体的构建
• 2.4.3 青蒿的遗传转化及再生
• 2.4.4 转基因青蒿的PCR 检测
• 2.4.5 转基因青蒿的Southern blot 分析
• 2.4.6 转基因青蒿中青蒿素含量的测定
• 2.5 讨论
• 第三章 ABA 处理对青蒿素含量及青蒿素合成途径中关键基因的影响
• 3.1 引言
• 3.2 材料与试剂
• 3.3 方法
• 3.3.1 青蒿苗的准备及ABA 处理
• 3.3.2 青蒿素含量的测定
• 3.3.3 青蒿悬浮细胞的培养
• 3.3.4 RT-PCR 半定量分析关键基因的表达情况
• 3.4 结果
• 3.4.1 ABA 处理后青蒿中青蒿素含量的变化
• 3.4.2 ABA 处理对青蒿素生物合成关键基因表达的影响
• 3.5 讨论
• 第四章 cyp71av1 基因启动子的克隆及功能分析
• 4.1 引言
• 4.2 材料与试剂
• 4.3 方法
• 4.3.1 植物材料及DNA 提取
• 4.3.2 Thermal Asymmetric Interlaced PCR （TAIL-PCR）
• 4.3.3 Genomic DNA walking
• 4.3.4 转录起始位点的确定
• 4.3.5 5’端缺失启动子与gus 报告基因的融合
• 4.4 结果
• 4.4.1 cyp71av1 基因启动子的克隆
• 4.4.2 转录起始位点的确定
• 4.4.3 cyp71av1 基因启动子的序列分析
• 4.4.4 5’端缺失启动子与gus 报告基因的融合
• 4.5 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录