砂梨核微卫星位点的开发和杂交F1代的SSR分析

论文摘要

核微卫星（Nuclear Microsatellite,nSSR）是非常有效的分子标记工具,广泛应用于植物遗传结构、系统发育、亲缘关系等研究,但目前梨的nSSR标记还很少。因此,本文应用精确预测法进行了砂梨核nSSR的开发,能为梨属果树及其近缘种遗传结构、亲缘关系等方面的研究提供有效工具。梨是原产于我国的最古老的果树种类之一,在水果生产中占有重要的地位。但是目前利用SSR技术构建梨遗传图谱的研究和应用较少,而梨遗传连锁图谱的构建和重要农艺性状和基因的定位对于拓展梨属的基因资源有着重大的意义。故本试验选用西子绿与喜水为杂交亲本及其F1代共77个样本为作图群体。运用SSR分子标记技术,初步构建了砂梨分子遗传图谱。本试验获得的主要成果如下:1以硅胶干燥保存的梨夏秋叶片为试材,对基因组DNA提取方法进行了研究。通过对CTAB方法的改进,提取梨DNA时不仅快速而且蛋白质、RNA、多糖等杂质较少,OD260/OD280在1.7-2.0之间,能满足酶切、PCR等试验的要求。同时对梅、苹果、桃、杏等果树夏秋叶片样品进行了通用性检验,同样高效快速地获得了高质量的DNA。2由于具高变异性、重复性、共显性、在真核生物中的丰富性使得SSR成为在DNA指纹图谱、亲缘关系分析、连锁图谱和群体遗传分析方面有用的分子工具。但SSR开发方法的效率限制了它的应用。本文利用改进的亲和捕捉法来富集微卫星,并采用精确预测（AFC）模型来开发梨SSR分子标记。结果126个阳性克隆中随机挑选60个,其中38个克隆获得了特异的产物富集效率达到63%;根据模型推荐的前10个克隆进行测序,10个序列均为完整的微卫星片段,测序效率达到100%。高效开发出了梨SSR分子标记。3通过优化PCR反应的退火温度和反应体系等参数,筛选多态性丰富的SSR引物,建立了适合梨的SSR分析技术体系:梨SSR分析的PCR反应体系以25μL为宜,含10×Buffer2.5μL,25mM MgCl2 1.5μL,2.5mM dNTP 1.6μL,15 ng/μL Primer各1.0μL,5U/μL Taq聚合酶0.15μL,模板DNA（50 ng/μL）2.0μL。各引物复性温度梯度试验结果表明,所筛选的12对SSR引物的最佳复性温度在45℃到50℃之间。从40对SSR引物中筛选获得在双亲间存在多态性的引物12对,多态性比例为30.7%,这些引物适合用于构建梨遗传图谱的SSR分析。4应用JoinMap3.0软件,初步构建了西子绿×喜水梨共4个遗传连锁群,包括12个孟德尔分离标记,覆盖梨基因组130.0cM,平均每两个连锁标记间的遗传距离为10.8cM,连锁群中标记间最大的遗传距离26.0cM,最小的遗传距离是6.0cM。其可,Group1和Group3连锁群分别含有4个标记,含标记数最多,长度分别为71.0cM,50.0cM,最长的连锁群Group1,长度为71.0cM,包括4个标记,最短的连锁群Group2只有2个标记,长度为19.0cM。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词（Abbreviation）
• 第一章 文献综述
• 1 微卫星简述
• 1.1 微卫星的特点
• 1.1.1 微卫星的丰度
• 1.1.2 微卫星的高多态性
• 1.1.3 微卫星引物及其保守性
• 1.2 微卫星开发策略
• 1.2.1 随机基因文库测序法
• 1.2.2 微卫星富集法
• 1.2.3 省略筛库法
• 1.2.4 STMP和SAM分离
• 1.2.5 数据库搜索
• 1.3 微卫星应用
• 1.3.1 植物遗传多样性分析
• 1.3.2 种质鉴定种品种分类
• 1.3.3 构建DNA指纹图谱
• 1.3.4 功能能基因定位和QTL分析
• 1.3.5 分子标记辅助选择
• 1.3.6 构建遗传连锁图谱
• 2 分子遗传图谱的构建
• 2.1 构建遗传图谱的理论依据和方法
• 2.1.1 构建遗传图谱的理论依据
• 2.1.2 构建遗传图谱基本方法
• 2.2 作图群体
• 2.2.1 亲本选配
• 2.2.2 分离群体类型选择
• 2.2.3 作图群体大小
• 2.3 分子标记选择
• 2.4 遗传作图的数据分析方法与统计学原理
• 2.5 构建遗传图谱的分析软件
• 3 梨分子遗传图谱研究进展
• 4 本研究的目的和意义
• 第二章 改良CTAB法提取果树硅胶干燥叶DNA
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 采样与保存
• 1.2.2 DNA的提取
• 1.2.3 DNA的检测与定量
• 1.2.4 DNA酶切检测
• 1.2.5 PCR检测
• 1.2.6 提取方法通用性检验
• 2 结果与分析
• 2.1 DNA浓度与质量
• 2.2 酶切效果
• 2.3 PCR检测
• 2.4 方法通用性检验
• 3 讨论
• 第三章 应用精确预测法开发梨微卫星位点
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 DNA提取
• 1.3 限制性DNA文库构建
• 1.4 双链接头合成和接头连接
• 1.5 限制性片段的PCR扩增
• 1.6 改进磁珠捕捉程序
• 1.7 PCR及产物克隆
• 1.8 克隆的巢式PCR检测
• 1.9 微卫星精确预测和SSR多态性验证
• 1.9.1 微卫星精确预测
• 1.9.2 SSR多态性验证
• 2 结果与分析
• 2.1 限制性片段的扩增
• 2.2 克隆及巢式PCR检测
• 2.3 精确预测
• 2.4 SSR位点多态性验证
• 3 讨论
• 1代SSR分析'>第四章 西子绿×和喜水梨F₁代SSR分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 模板DNA制备
• 1.2.2 DNA的检测与定量
• 1.2.3 SSR标记的PCR体系建立
• 1.2.4 SSR引物筛选
• 1.2.5 作图群体SSR分析
• 1.2.5.1 PCR扩增
• 1.2.5.2 银染分析
• 1.2.6 连锁分析与遗传作图
• 2 结果分析
• 2.1 PCR技术体系的优化
• 2.1.1 PCR反应体系总体积
• 2.1.2 引物复性温度确定
• 2.2 SSR引物筛选
• 2.3 作图群体SSR分析
• 2.3.1 孟德尔分离
• 2.3.2 偏离孟德尔分离规律
• 2.3.3 不同分离类型SSR标记的出现频率
• 2.4 连锁分析与遗传作图
• 3 讨论
• 3.1 作图群体的选择
• 3.2 SSR分析中优化PCR反应体积和复性温度的必要性
• 3.3 分子标记的选择
• 全文总结
• 参考文献
• 附录
• 致谢