鳙鳃凝集素的分离纯化、理化性质及生物学活性研究

论文摘要

鳙（Aristichthys nobilis）是我国产量较大的一种淡水鱼类食物资源,具有生长速度快、疾病少、个体大等特点。近些年来,鳙的加工利用研究取得了长足的发展,鳙产业逐步走向良性发展的道路。为了提升鳃这种加工废弃物的价值,探索鳙鳃的综合利用可行性,本文从鳙鳃中分离纯化凝集素,主要研究内容如下:从鳙鳃主要化学组成看来,鳙鳃的蛋白质含量与鱼体相当,是一种可综合利用的下脚料。分析表明,鳙鳃中含有高活性的凝集素,最优提取工艺为:缓冲体系为22.81 mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH 8.5）、料液比1∶6、提取时间16.43 h。在该条件下实际提取比活力为8125.49 9647.06 HU/mg。建立了一种包括DEAE-Sepharose FF离子交换层析、Sephacryl S-200 HR凝胶过滤层析及Superdex 200 10/300 GL液相快速蛋白层析技术的分离纯化工艺,从鳙鳃中分离纯化到一种对岩藻糖专一结合的凝集素,命名为GANL（gill of Aristichthys nobilis lectin）。本工艺的纯化倍数为21.4倍,蛋白质回收率为3.6%。纯化凝集素在SDS-PAGE上显示单一蛋白质条带。研究了鳙鳃凝集素的物理化学性质及其活性的影响因素,发现在供试的六种动物红细胞及人的A、B及O型血红细胞中,鳙鳃凝集素仅能凝集兔红细胞及人的O型血红细胞,表现出较强的供血动物种属专一性。鳙鳃凝集素的活性仅被岩藻糖抑制,糖结合专一性较强。鳙鳃凝集素具有较高的耐热性,最适作用温度为50℃,90℃处理30 min仍能保持相当高的活性;对酸敏感,最适作用pH为89,在碱性环境中较为稳定,pH为11时还能保持一定的活性;鳙鳃凝集素的活性不依赖Ca2+、Mn2+及Mg2+,受还原剂β-巯基乙醇、表面活性剂SDS及胰蛋白酶水解、琥珀酰化修饰显著影响,而DMSO及三氟乙酸两种试剂对鳙鳃凝集素的活性没有显著影响。对鳙鳃凝集素的分子结构进行了初步的表征。鳙鳃凝集素是一种相对分子质量为2.20×105的糖蛋白,由六个相对分子质量为3.55×104的相同亚基组成。分子中糖含量为13.4 %,糖链与蛋白质部分的连接方式为O-糖苷键。鳙鳃凝集素含有0.81 %的Cys-S,结构较复杂,在非还原SDS-PAGE中显示一种梯状条带,分子中α-螺旋含量为34.8 %、β-折叠含量12.1 %、β-转角含量24.5 %和无规卷曲含量33.0 %。发现在供试的三种微藻中,鳙鳃凝集素仅能凝集雨生红球藻且这种凝集作用与藻细胞浓度有关。发现在供试的七种微生物中,鳙鳃凝集素能凝集鳗弧菌、哈维氏弧菌两种革兰氏阴性鱼类病原微生物,表现出较强的专一性。鳙鳃凝集素能抑制鳗弧菌、哈维氏弧菌的生长,这种抑制作用被0.2 mol/L的岩藻糖解除,说明鳙鳃凝集素对细菌的抑制作用与糖结合域有关。发现鳙鳃凝集素对HeLa、SKOV3、HepG2三株细胞具有一定的抑制作用,其中对HeLa细胞株的抑制作用具有剂量依赖关系,IC50为11.86μg/mL,而对SKOV3及HepG2的抑制作用剂量依赖性不明显。发现鳙鳃凝集素对未经诱导的小鼠脾淋巴细胞的生长有一定的促进作用,经ConA诱导后鳙鳃凝集素的促进生长作用有明显的提高,而经LPS诱导后鳙鳃凝集素的作用并没有明显提高。因此,推测鳙鳃凝集素具有一定促进T细胞有丝分裂的作用,而对B细胞没有作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 鳙生物学概述
• 1.2 鳙的加工利用
• 1.2.1 鳙的营养价值
• 1.2.2 鳙的加工利用现状
• 1.3 凝集素
• 1.3.1 凝集素的定义
• 1.3.2 凝集素的分布
• 1.3.3 凝集素的分类
• 1.3.4 凝集素的应用
• 1.4 鱼类凝集素的研究进展
• 1.4.1 动物凝集素的研究概况
• 1.4.2 鱼类凝集素的分布
• 1.4.3 鱼类凝集素的分类
• 1.4.4 鱼类凝集素的性质
• 1.4.5 鱼类凝集素的生物学活性
• 1.5 立题背景和意义
• 1.6 本论文的主要研究内容
• 参考文献
• 第二章 鳙鳃成分分析及凝集素的提取工艺研究.
• 2.1 前言
• 2.2 材料与仪器
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 鳙鳃主要成分分析
• 2.3.2 血凝活性测定
• 2.3.3 蛋白质浓度测定方法的改良
• 2.3.4 提取单因素实验
• 2.3.5 提取工艺优化
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 原料成分分析
• 2.4.2 红细胞专一性的测定
• 2.4.3 考马斯亮蓝法测定微量蛋白质含量的改良
• 2.4.4 单因素实验
• 2.4.5 提取工艺的响应面分析法优化
• 2.5 本章小结
• 参考文献
• 第三章 鳙鳃凝集素的分离纯化及理化性质研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与仪器
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 主要仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 血凝活性测定
• 3.3.2 蛋白质含量测定
• 3.3.3 离子交换层析
• 3.3.4 凝胶过滤层析
• 3.3.5 糖结合专一性测定
• 3.3.6 二价阳离子依赖性及EDTA 对凝集活性影响的测定
• 3.3.7 热稳定性测定
• 3.3.8 pH 稳定性测定
• 3.3.9 鳙鳃凝集素熔点的测定
• 3.3.10 胰蛋白酶对凝集素稳定性的影响
• 3.3.11 琥珀酰化对凝集素的影响
• 3.3.12 SDS、DMSO、β-巯基乙醇、三氟乙酸对凝集素的影响
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 离子交换层析
• 3.4.2 凝胶过滤层析
• 3.4.3 糖结合专一性测定
• 3.4.4 温度、pH 及二价阳离子对GANL 活性的影响
• 3.4.5 鳙鳃凝集素的熔点
• 3.4.6 胰蛋白酶对凝集素稳定性的影响
• 3.4.7 琥珀酰化对凝集素的影响
• 3.4.8 SDS、DMSO、β-巯基乙醇、三氟乙酸对凝集素的影响
• 3.5 本章小结
• 参考文献
• 第四章 鳙鳃凝集素的结构表征
• 4.1 前言
• 4.2 材料与仪器
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 主要仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 相对分子质量测定
• 4.3.2 亚基相对分子质量测定
• 4.3 3 中性糖含量的测定
• 4.3.4 糖苷键的分析
• 4.3.5 鳙鳃凝集素的氨基酸组成
• 4.3.6 FT-IR 光谱测定
• 4.3.7 圆二色光谱（CD）测定.
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 鳙鳃凝集素相对分子质量
• 4.4.2 亚基相对分子质量测定
• 4.4.3 中性糖含量测定
• 4.4.4 糖苷键分析
• 4.4.5 鳙鳃凝集素的氨基酸组成
• 4.4.6 FT-IR 红外光谱分析
• 4.4.7 远紫外圆二色光谱（CD）分析
• 4.5 本章小结
• 参考文献
• 第五章 鳙鳃凝集素的部分生物学活性研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料与仪器
• 5.2.1 材料
• 5.2.2 主要仪器
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 微藻凝集实验
• 5.3.2 细菌及酵母凝集实验
• 5.3.3 细菌生长抑制实验
• 5.3.4 真菌生长抑制实验
• 5.3.5 动物细胞培养用试剂的配制与除菌
• 5.3.6 细胞的复苏
• 5.3.7 细胞的传代
• 5.3.8 鳙鳃凝集素对肿瘤细胞作用的初筛
• 5.3.9 鳙鳃凝集素对肿瘤细胞作用的量效关系及时效关系的测定
• 5.3.10 凝集素对肿瘤细胞形态影响的观察
• 5.3.11 细胞的冻存
• 5.3.12 小鼠脾细胞的制备
• 5.3.13 鳙鳃凝集素促脾细胞有丝分裂的测定
• 5.4 结果与分析
• 5.4.1 微藻细胞凝集作用
• 5.4.2 细菌及酵母凝集作用
• 5.4.3 微生物生长抑制作用
• 5.4.4 鳙鳃凝集素对肿瘤细胞的体外增殖抑制作用
• 5.4.5 鳙鳃凝集素对肿瘤细胞形态影响的观察
• 5.4.6 鳙鳃凝集素的促有丝分裂作用测定
• 5.5 本章小结
• 参考文献
• 主要结论
• 展望
• 论文创新点
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的学术论文
• 附录