论文摘要
背景和目的：内皮祖细胞（Endothelial progenitor cells, EPCs）是一类具有高度增殖潜能并能分化为成熟内皮细胞的血管前体细胞群，循环中的EPCs在血管修复和维持脉管稳定方面发挥极其重要的作用。同时，出生后定居于骨髓中的EPCs在生理或不同的病理状态的刺激下能从骨髓中动员并归巢至缺血或血管新生区域，以类似于胚胎时期血管发生的方式或旁分泌机制参与新生血管的形成。胶质瘤是颅内最常见的原发性肿瘤，是人体富血管肿瘤之一，在胶质瘤发生发展过程中，伴随大量肿瘤新生血管的形成。研究表明，EPCs能特异性归巢至肿瘤生长活跃的“热点”部位，参与肿瘤血管的形成。我们前期研究也发现，肿瘤周边的肿瘤微血管密度最高，经静脉移植的外源性EPCs到达胶质瘤组织后，优先集中分布于肿瘤的周边区域。基于EPCs的这一特性，许多学者认为有望通过移植磁性标记的EPCs、采用影像学相关成像技术，如磁共振成像（Magnetic resonance imaging,MRI）技术来检测胶质瘤的浸润或卫星病灶，从而提高胶质瘤的临床诊治水平。前期相关实验证实利用MRI短期内可以观察到磁性标记的EPCs在胶质瘤组织的动态分布特征。但是，随着时间的延长，MRI对移植细胞的检出率变低，不能达到进一步观测的目的。另外，虽然多数移植的EPCs归巢至脑胶质瘤组织，但是大鼠脾脏组织内依然发现少数移植的EPCs。因此，如何增强EPCs靶向胶质瘤的能力和在体内的增殖活性是首要解决的问题。胶质瘤在发生发展过程中，肿瘤周边破坏的神经元和肿瘤自身增生的胶质细胞释放大量ATP至细胞外，ATP不但是细胞内的能源物质，也是细胞P2受体的内源性天然配体。P2X7受体亚型分布较广泛，造血干细胞及多数骨髓细胞，包括单核细胞等均有表达，P2X7受体激活后可以促进细胞增殖、分化、凋亡和迁移。EPCs与造血干细胞共同起源于成血管细胞，两者表达许多相同的细胞表面标志物，如CD34。基于此，我们推测，EPCs也可能存在P2X7受体的表达，激活P2X7受体有可能促进EPCs的增殖并提高其靶向归巢的能力。C6胶质瘤细胞是脑胶质瘤研究中应用最为广泛的细胞，亦是本研究拟采用的肿瘤细胞，据报道其也有P2X7受体的表达。那么，我们采用系统给药激活EPCs的P2X7受体时是否会影响胶质瘤自身的发展呢？迄今为止，P2X7受体对C6胶质瘤细胞的作用途径、作用程度以及对P2X7受体活性干预是否能够影响肿瘤的生长等问题的相关研究报道较少，有些方面甚至尚未涉及，有关研究结果也存在一定的争议。因此，P2X7受体在胶质瘤中的作用尚需要进一步的研究。为验证上述假设，本实验分两部分进行。第一部分通过免疫蛋白印迹及免疫荧光染色验证P2X7受体在EPCs的表达，并通过应用BzATP激活P2X7受体，观察P2X7受体激活对EPCs增殖、凋亡和迁移的影响。同时，应用BBG持续干预胶质瘤大鼠，观察P2X7受体抑制对EPCs靶向归巢的影响。第二部分，通过免疫蛋白印迹及免疫荧光染色验证P2X7受体在C6胶质瘤细胞的表达，并通过检测P2X7受体激活后C6胶质瘤细胞内钙离子浓度的改变，明确C6胶质瘤细胞P2X7受体通道的功能，通过Ki-67荧光染色、MTT分析以及RNA干扰，验证P2X7受体对C6胶质瘤细胞增殖的影响。同时，持续应用BBG干预原位脑胶质瘤模型大鼠，观察其对胶质瘤生长的影响。最终，明确P2X7受体激活对EPCs靶向归巢及增殖的影响，以及对胶质瘤自身生长的影响，评价P2X7受体调控EPCs靶向和增殖的可行性和安全性。材料和方法：整个研究由离体实验和在体实验两部分组成。离体实验以培养的大鼠脾脏来源的EPCs以及C6胶质瘤细胞系为研究对象。在体实验采用SD大鼠原位脑胶质瘤模型。一、P2X7受体对大鼠脾源性EPCs增殖、凋亡、迁移和示踪影响的研究1．采用密度梯度离心法从SD大鼠脾脏组织中获取单个核细胞，培养3天后首次换液并用DPBS洗去非贴壁细胞，之后每隔3天更换一次培养基。根据细胞培养过程中出现的特殊形态学以及DiI-acLDL和FITC-UEA-1双染色阳性等特征，对培养的贴壁细胞进行鉴定。2．用免疫蛋白印迹检测P2X7受体在EPCs的表达；用免疫荧光染色法检测P2X7受体在EPCs中的分布特征。3．应用不同浓度BzATP刺激EPCs，比率荧光成像系统观测BzATP刺激下EPCs细胞内钙离子浓度的变化；采用BBG同时干预EPCs，检测P2X7受体抑制剂对细胞内钙离子浓度的影响。4．将EPCs分为三组：对照组、BzATP干预组、BBG+BzATP干预组，37℃，5%CO2孵育24h后MTT法检测光密度值反映P2X7受体激活对EPCs增殖活力的影响。5．采用培养至7天左右的EPCs，应用BzATP或BBG+BzATP干预，通过磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）检测P2X7受体激活对EPCs凋亡的影响。6．应用划痕实验检测P2X7受体激活对EPCs迁移能力的影响。7．采用C6胶质瘤细胞利用大鼠脑立体定位仪建立SD大鼠原位脑胶质瘤模型。磁共振成像和病理普鲁士蓝染色检测EPCs在胶质瘤组织的分布特征。8．免疫蛋白印迹检测胶质瘤组织CXCL1和单核细胞趋化蛋白（Monocytechemoattractant protein-1, MCP-1）的表达。二、P2X7受体调控对原位脑胶质瘤生长影响的影像学研究1．用免疫蛋白印迹检测P2X7受体在C6胶质瘤细胞的表达；用免疫荧光染色法检测P2X7受体在C6胶质瘤细胞的分布。2．应用不同浓度BzATP刺激C6胶质瘤细胞，比率荧光成像系统检测BzATP刺激下C6胶质瘤细胞内钙离子浓度的变化，观察P2X7受体抑制剂对细胞内钙离子信号变化的影响。3．应用不同浓度BBG刺激C6胶质瘤细胞，同时分别用BzATP、suramin（P2Y2受体抑制剂）和gefitinib（EGFR抑制剂）进行干预，用Ki-67荧光染色法和MTT分析法检测P2X7受体对C6胶质瘤细胞增殖的影响。4．体外培养C6胶质瘤细胞，应用BBG进行刺激，同时用BzATP进行干预，免疫蛋白印迹检测C6胶质瘤细胞P2X7受体、EGFR、p-EGFR蛋白以及P2Y2受体表达的变化。5．用RNA干扰敲减C6胶质瘤细胞P2X7受体的表达，MTT法检测P2X7受体敲减对C6胶质瘤细胞增殖能力的影响。6．免疫蛋白印迹检测P2X7受体敲减后C6胶质瘤细胞EGFR和p-EGFR蛋白表达的变化。7．应用BzATP对P2X7受体敲减后的C6胶质瘤细胞进行刺激，免疫蛋白印迹检测BzATP对P2X7受体表达的影响。8．分四组：对照组、BBG干预组、空病毒组、受体敲减组，建立SD大鼠原位脑胶质瘤模型。磁共振成像评价各组胶质瘤大小，CT灌注成像评价各组胶质瘤血管生成情况。9．应用Nissl染色检测各组胶质瘤相对瘤体大小，Ki-67染色检测各组胶质瘤细胞增殖情况、VEGF和EGFR免疫组化染色检测各组胶质瘤组织VEGF和EGFR表达的变化、CD34免疫组化染色检测各组胶质瘤组织微血管密度。10．免疫蛋白印迹检测各组胶质瘤组织EGFR、p-EGFR、P2X7、VEGF、HIF-1α、P2Y2和caspase-3蛋白表达结果：一、P2X7受体对大鼠脾源性EPCs增殖、凋亡、迁移和示踪影响的研究1．最初从脾脏分离得到的单个核细胞接种后呈圆形，之后随着培养时间的延长，贴壁细胞开始变大、透亮度增强并出现梭形细胞。随着培养时间的进一步延长，贴壁细胞中出现较多的梭形细胞，并可见细胞呈“铺路石”样排列。培养一周，荧光显微镜检测贴壁细胞中DiI-acLDL和FITC-UEA-1双染色阳性细胞百分率大于90%。2．免疫蛋白印迹及免疫荧光染色均检测到大鼠脾脏来源EPCs有P2X7受体的表达。3．BzATP刺激EPCs能引起EPCs内钙离子浓度的升高，其升高幅度与BzATP呈浓度依赖。P2X7受体抑制剂（BBG）预处理能抑制EPCs这种细胞内钙离子信号的改变。4．BzATP刺激能增强EPCs的增殖活力，而BBG干预能抑制BzATP对EPCs增殖的影响。5．Annexin及PI染色显示BzATP刺激使得出现较多凋亡细胞，但是与对照组比较无统计学差异。6．BzATP刺激能增强EPCs的迁移能力，而BBG干预能抵抗BzATP对EPCs的这一作用。7．C6胶质瘤细胞接种后10天左右磁共振成像扫描，各组模型大鼠均可见接种侧脑实质内肿瘤形成，T2WI上呈高信号，增强扫描明显强化。尾静脉移植USPIO标记的EPCs后第1天扫描，T2WI观察到肿瘤周边的低信号。普鲁士蓝染色后肿瘤组织内见大量蓝染细胞，主要集中在肿瘤内的血管区域。BBG干预的胶质瘤组织中蓝染颗粒数明显低于对照组。8．BBG能显著抑制胶质瘤组织CXCL1的表达，但对MCP-1蛋白的表达无明显影响。二、P2X7受体调控对原位脑胶质瘤生长影响的影像学研究1．P2X7受体在胶质瘤组织及离体培养的C6胶质瘤细胞中均有表达。2．BzATP刺激C6胶质瘤细胞引起细胞内浓度依赖性的钙离子浓度升高，而采用BBG预处理后可显著降低BzATP诱导的钙离子浓度升高。3．较低浓度BBG刺激对C6胶质瘤细胞增殖影响不大，稍高浓度BBG呈浓度依赖性促进C6胶质瘤细胞增殖。BzATP干预不能对抗BBG的这一效应，但是gefitinib和suramin干预能显著抑制BBG对C6胶质瘤细胞的这一作用。4．BBG刺激可显著下调C6胶质瘤细胞P2X7受体的表达，BzATP干预可抑制P2X7表达的下调。相反地，BBG刺激可以显著上调C6胶质瘤细胞EGFR、p-EGFR蛋白和P2Y2受体的表达。5．RNA干扰可显著降低C6胶质瘤细胞P2X7受体的表达，P2X7受体表达下降后细胞增殖能力确明显增强。6．在C6胶质瘤细胞中敲减P2X7受体，使得C6胶质瘤细胞EGFR和p-EGFR蛋白以及P2Y2受体表达显著增加。7．虽然BzATP刺激能轻度增加RNA干扰后的C6胶质瘤细胞P2X7受体的表达，但与未干预组比较无明显差异。8．各组胶质瘤模型在C6细胞接种后10天，磁共振成像均能发现类圆形肿瘤的形成。随着观察时间的延长，各组胶质瘤大小均显著增加。BBG干预组和受体敲减组胶质瘤各观测时间点瘤体体积明显大于对照组或空病毒组，对照组与空病毒组之间无明显差异。BBG干预或P2X7受体敲减均能显著升高胶质瘤组织的rCBV和PS值。9．受体敲减或持续的BBG干预能促进胶质瘤细胞的显著增殖，使得同一观察时间点肿瘤的大小明显增加以及EGFR和VEGF的表达增加。10．持续抑制P2X7受体的表达（应用BBG或P2X7受体敲减）能明显减少胶质瘤组织的P2X7受体的表达，但能显著上调胶质瘤组织EGFR、p-EGFR、VEGF、HIF-1α和P2Y2受体蛋白表达。虽然C6胶质瘤细胞P2X7受体敲减后，caspase-3蛋白稍降低，但差异不明显。结论：1.激活P2X7受体通道可增强EPCs的增殖活性和迁移能力。2. USPIO标记的EPCs能归巢至胶质瘤组织的血管区域，给予P2X7受体抑制剂能显著抑制外源性EPCs在胶质瘤组织的聚集，提示通过调控P2X7受体改变EPCs靶向归巢能力的可行性。3.抑制P2X7受体能增加C6胶质瘤细胞P2Y2的表达；从而转导活化EGFR蛋白，促进C6胶质瘤细胞的增殖。4.抑制P2X7受体能上调胶质瘤组织EGFR和HIF-α蛋白的表达，增加促血管生成因子VEGF的表达，促进肿瘤血管形成，进一步促进胶质瘤生长。5.因此，根据以上实验结果，本研究认为通过激活P2X7受体可以增强EPCs的增殖和靶向胶质瘤归巢的能力，达到使其更好发挥MRI靶向显影及示踪探针的目的；同时，C6胶质瘤细胞的P2X7受体可能起抑瘤效应，因此激活EPCs的P2X7受体极有可能不会促进肿瘤的生长，具有较好的生物安全性。