转基因牛基因芯片检测方法的建立

论文摘要

转基因技术是把“双刃剑”在给人类带来经济和社会利益的同时,也引发了许多问题。因转基因动物是人类将所需要的优良基因转入受体体内所得,并非自然界本来存在,所以比自然界本来存在的生物更具生存优势和竞争力,同时也加大了它的潜在威胁。短期内转基因动物对人类健康的直接影响较小,但是长期、潜在的影响还很难定论；其可能还会通过跨物种感染影响生态环境和生物多样性,因此转基因动物的安全性有待进一步考察。随着转基因技术的发展,转基因动物商品化的范围会逐步扩大,为做到防患于未然,有必要进行科学的检测。目前GMO的检测主要集中在转基因作物及其产品方面,转基因动物的检测体系还未建立完善,因此对转基因动物及其产品检测方法的研究在口岸未来的监测工作中具有一定的意义。转基因产品的检测目前主要是以PCR为主的DNA检测方法和蛋白质检测方法,一次只能检测一个基因或一种样品,已不能满足现阶段转基因产品种类和数量不断增多的现状。寡核苷酸基因芯片因具有高通量、微型化的特点,可以对同一转基因样品进行不同方面的分析以及对多种转基因样品同时进行检测,适合转基因产品的检测本研究是应用基因芯片结合多重PCR的方法对转基因牛进行检测,首先根据能代表种属特异性的线粒体基因：牛线粒体16s rRNA基因（BOS mtDNA16s rRNA, BOS）、羊线粒体12s rRNA基因（Ovis mtDNA12s rRNA）、猪线粒体NADH5基因（Sus NADH5）;和转基因动物常用的标记基因：新霉素磷酸转移酶编码基因（NPTⅡ）、绿色荧光蛋白编码基因（EGFP）;以及特异的外源转入基因：人乳铁蛋白编码基因（Human Lactoferrin gene, hLF）、人-α-乳清蛋白编码基因（Humanα-Lactalbumin gene, ha-LALBA）基因、人溶菌酶编码基因（Human Lysozyme gene, hLYZ）,应用DNA star、Primer 5.0、MEGA、DNAMAN、AnnHyb等生物学软件比对、筛选设计了8对符合多重PCR的特异性引物和16条特异性基因芯片70mer探针,均具有良好的特异性。通过对该方法扩增条件的优化,成功建立多重PCR方法。通过对多重不对称PCR上下游引物比例的优化,杂交体系、杂交条件的优化,洗涤条件的优化,建立了一种转基因牛检测型基因芯片,试验结果表明针对8种基因的16条特异性探针均得到了较好的杂交结果,特异性强,与转人防御素3基因奶牛样品、转omega-3基样品等均无交叉反应,灵敏度高,检测极限达1pg,适合转基因牛的检测。本研究建立了一种转基因牛基因芯片检测方法,不仅可以对牛、羊、猪进行动物源性的检测,还可以筛查转基因牛样品,又可以进一步确认转基因牛外源基因。本研究是对转基因动物及其产品检测技术的一种初步探索。此方法可以为转基因动物及其产品的检测提供技术储备,为相关领域检测技术的发展奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1 转基因生物研究概况
• 1.1 转基因生物定义
• 1.2 转基因生物的发展概况
• 2 转基因生物安全
• 2.1 转基因作物的安全性问题
• 2.2 转基因动物的安全性问题
• 3 转基因生物检测方法
• 3.1 生物学鉴定法
• 3.2 蛋白质检测方法
• 3.3 DNA检测方法
• 4 本研究的目的和意义
• 第2章 转基因牛基因芯片检测方法研究
• 1 实验材料
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验试剂
• 1.3 主要仪器及设备
• 1.4 主要试剂的配制
• 2 实验方法
• 2.1 检测型基因芯片的研制
• 2.2. 多重不对称PCR体系的建立及优化
• 3 结果与分析
• 3.1 引物的设计与评价
• 3.2 阳性质粒的构建
• 3.3 多重不对称PCR体系的建立及优化
• 3.4 杂交条件的优化
• 3.5 芯片有效性试验结果
• 3.6 芯片特异性试验结果
• 3.7 芯片敏感性试验结果
• 4 讨论
• 4.1 多重PCR引物的设计与评价
• 4.2 70mer探针的选择与设计
• 4.3 质控系统的作用
• 4.4 多重不对称PCR体系的优化与组合的选择
• 4.5 甲酰胺在杂交中的作用及相关条件优化
• 4.6 基因芯片检测方法的特异性、敏感性、稳定性
• 4.7 基因芯片扫描阳性结果的判读
• 第3章 结论与小结
• 3.1 结论
• 3.2 创新之处
• 3.3 展望
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文及研究成果
• 致谢