抗旱相关基因AtRD28和AtCBF4在番茄中的异源表达

论文摘要

干旱是影响植物生长发育的主要非生物胁迫因子,是制约我国农业发展的主要因素之一。据统计,干旱给农业生产造成的损失几乎是其它自然灾害所造成损失的总和。面对日益频繁的自然灾害,如何节约农业生产用水以及如何利用大面积的干旱、半干旱土地发展农业是人类迫切需要解决的重大课题。传统的育种方法在耐旱性改良方面进展缓慢,现代生物学与生物技术的发展,使人们能够从分子水平上认识植物与抗旱之间的关系,通过分子育种提高作物耐早性,为抗旱育种开辟了新的途径。有大量研究报道,将拟南芥（Arabidopsis thaliana）的一些抗旱相关基因异源转化到烟草、油菜等中,均能增强这些植物抵抗干旱逆境胁迫的能力。本研究将拟南芥AtRD28基因和AtCBF4基因导入番茄（Solanum lycopersicum）,拟通过目的基因在番茄中超量表达研究其对干旱逆境胁迫的抗性能力,获得转基因抗性植株,应用于番茄抗旱遗传育种。本研究获得的主要结果有:1.根据GenBank中公布的拟南芥RD28基因（D13254）和CBF4基因（NM124578）的序列信息,克隆了两个基因的全长cDNA。测序结果与公布序列同源性100%,所克隆到的AtRD28基因片段长1018 bp,其中CDS为858bp,编码285个氨基酸;AtCBF4基因片段长769 bp,CDS为675 bp,编码224个氨基酸。2.分别构建了AtRD28基因和AtCBF4基因的超量表达载体;利用农杆菌介导的遗传转化方法将其成功导入番茄品种ZS5和A53中。3.番茄遗传转化共获得卡那霉素抗性植株78株,其中转AtRD28基因共38株,转AtCBF4基因共40株,PCR检测结果表明,外源基因已整合到番茄基因组中。4.转基因番茄后代与对照种子经15%PEG（6000）胁迫处理,测定其在萌芽期对渗透胁迫的耐受性,发现转基因材料的发芽率较对照有显著提高。转基因材料的发芽率都接近或超过对照材料料的2倍;其中转AtRD28基因的两个株系RD-1和RD3-7的发芽率分别较对照提高了32.5%和34.16%,转AtCBF4基因的株系CBF-1的发芽率较对照提高了25%。5.转基因植株苗期抗旱性检测试验表明,转基因番茄幼苗在三叶一心期对干旱的耐受性明显高于对照。连续3次干旱胁迫处理后,转基因植株的存活率较对照均有所提高。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 课题的提出
• 1.2 干旱环境胁迫对植物的伤害
• 1.3 植物的抗旱性研究
• 1.3.1 植物适应干旱的方式
• 1.3.2 植物适应干旱的生理生化机制
• 1.4 植物在干旱胁迫下诱导表达的基因及蛋白
• 1.5 植物干旱胁迫应答基因的表达调控
• 1.6 AtRD28和AtCBF4基因的研究现状
• 1.6.1 AtRD28基因的研究现状
• 1.6.2 AtCBF4转录因子的研究现状
• 1.7 本研究的目的和内容
• 2 材料与方法
• 2.1 植物材料
• 2.2 菌株、质粒及主要载体
• 2.3 基本培养基
• 2.4 所用引物
• 2.5 目的基因的克隆
• 2.5.1 反转录
• 2.5.2 目的基因的扩增
• 2.5.3 PCR产物的回收和纯化
• 2.5.4 TA克隆
• 2.6 植物表达载体的构建
• 2.6.1 酶切反应
• 2.6.2 连接反应
• 2.6.3 重组质粒pBISA4-RD28和pBISA4-CBF4的方向鉴定
• 2.6.4 转化农杆菌
• 2.7 番茄的遗传转化
• 2.8 转基因番茄植株的PCR检测
• 2.9 转基因番茄植株的半定量RT-PCR分析
• 2.10 转基因番茄植株抗旱性初步分析
• 2.10.1 萌芽期抗旱性鉴定
• 2.10.2 幼苗期抗旱性鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 目的基因的克隆
• 3.1.1 拟南芥总RNA的质量检测
• 3.1.2 AtRD28基因和AtCBF4基因片段的扩增
• 3.1.3 AtRD28和AtCBF4基因扩增片段的鉴定
• 3.2 目的基因正义（超量）表达载体的构建
• 3.3 番茄的遗传转化
• 3.4 转基因番茄植株的分子检测
• 3.4.1 转基因植株的PCR检测
• 3.4.2 T1代转基因番茄植株的PCR检测
• 3.5 部分转基因番茄植株的半定量PT-PCR检测
• 3.6 转基因番茄抗旱性初步分析
• 3.6.1 萌芽期抗旱性鉴定
• 3.6.2 幼苗期的抗旱性鉴定
• 4 讨论
• 4.1 外源基因导入与植物的抗旱性研究及生物信息学的应用
• 4.2 植物表达载体与启动子
• 4.3 CBF/DREB转录因子的前景
• 4.4 转基因插入失活现象
• 5 对后续工作的展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 附录一:植物DNA的小量法提取程序
• 附录二:TriZOL一步法提取植物总RNA方法
• 附录三:质粒的小量提取方法
• 附录四:大肠杆菌热击感受态的制备
• 附录五:农杆菌感受态细胞的制备
• 附录六:AtRD28基因测序结果比对分析
• 附录七:AtCBF4基因测序结果比对分析