胰岛素和鹿茸血抗骨质疏松的生物效应和机制研究

论文摘要

糖尿病影响骨代谢,导致骨量减少,诱发骨质疏松,但是糖尿病性骨质疏松的发病机制仍不十分清楚。胰岛素是骨形成促进因子,对成骨细胞的增殖、分化和成熟具有促进作用,但是具体的作用机制也不清楚。本文通过体内和体外实验,探讨了胰岛素缺乏导致骨质疏松的发病机制以及胰岛素促进骨生长和分化的分子作用机制,为预防骨质疏松提供一定的理论依据。营养指导,饮食补充等非药物预防策略干预骨质疏松已受到人们的广泛重视,从中药中筛选抗骨质疏松药物具有广阔的应用前景。本文探讨了鹿茸血缓解去势大鼠骨质疏松的生物学效应机制。主要结果如下：发现糖尿病引起钙（Ca）、磷（P）、镁（Mg）、锌（Zn）、锶（Sr）等骨矿元素流失以及血清睾酮（T）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）和骨钙素（OC）等水平的降低是糖尿病骨密度（BMD）降低的重要原因,而胰岛素处理能够提高Ca、P、Mg等骨矿元素含量,恢复血清T、IGF-1和OC的水平,增加骨密度,缓解骨质疏松。接着,通过细胞分子生物学的研究,进一步阐明了胰岛素通过激活MAPK通路上调Osx和IGF-1的表达,与激活PI3K通路下调Runx2的表达促进成骨细胞生长和分化的分子作用机制。该结果进一步阐明了糖尿病性骨质疏松的发病机制,为胰岛素预防和治疗糖尿病性骨质疏松提供一定的理论指导并在临床应用方面具有一定的现实意义。此外,首次报道了鹿茸血通过提高Ca、P和Zn等骨矿元素水平以及通过提高血清T和IGF-1的水平,缓解去势大鼠骨质疏松的生物学效应机制。为鹿茸血抗骨质疏松的应用提供一定的理论依据。绪论中,从影响成骨细胞生长、分化的调节因子、信号通路以及转录因子等方面,简要综述了骨质疏松的发病机制。首次运用同步辐射X射线荧光探针分析技术（SRXRF）,发现糖尿病引起钙Ca、P、Zn、Sr等骨矿元素流失是导致骨密度降低的重要原因之一,从骨矿元素变化阐明了糖尿病性骨质疏松的发病机制。研究表明：糖尿病组骨密度显著低于对照组（P<0.01）,同时Ca、P和Zn元素的相对含量明显低于对照组（P<0.01）；与对照组相比,糖尿病组中Sr元素的相对含量降低11%；而糖尿病大鼠硫（S）元素的相对含量显著高于对照组（P<0.01）。元素铬（Cr）,铜（Cu）,铅（Pb）的相对含量在两组间无显著差异。统计分析显示Ca分别和P（R=0.85,P<0.001）,Sr（R=0.38,P<0.05）,Zn（R=0.37,P<0.05）呈正相关性；而Zn和S呈负相关性（R=-0.40,P<0.05）。首次利用电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）,发现胰岛素治疗可以通过提高Ca、P、Mg等元素的含量使骨密度得到恢复,缓解骨质疏松,表明胰岛素具有骨形成促进作用,同时也进一步证明糖尿病大鼠股骨中Ca、P、Mg、Sr、K等元素的丢失是导致BMD降低的原因之一。研究表明：与正常组相比,糖尿病组大鼠股骨骨密度显著降低（P<0.01）,胰岛素治疗后显著升高（P<0.05）。ICP-AES元素分析结果显示：与正常组相比,糖尿病组大鼠股骨中Ca、P、Mg、Sr、K等5种元素含量显著降低（P<0.05）,而胰岛素治疗后,元素Ca、P、Mg含量得到了恢复（P<0.05）。相关性分析显示：正常组大鼠股骨的Ca、P、Mg元素含量间具有很高的相关性。接着,报道了糖尿病引起血清睾酮、胰岛素样生长因子-1和骨钙素等的降低也是导致BMD降低的原因之一,而胰岛素治疗可以恢复血清睾酮、胰岛素样生长因子-1和骨钙素水平,预防骨流失和BMD降低,进一步证明了胰岛素的骨形成促进作用。实验结果表明：（1）、糖尿病组大鼠的骨密度显著降低（P<0.01）,小梁骨间距明显增加,骨小梁流失显著（P<0.01）,而胰岛素治疗可以降低骨流失,恢复骨密度；（2）、糖尿病组血清睾酮水平显著降低（P<0.01）,胰岛素治疗后,睾酮水平升高；（3）、糖尿病组血清中骨保护素、胰岛素样生长因子-1和骨钙素也明显降低（P<0.01）,经胰岛素治疗后其相应水平提高；（4）、而糖尿病组血清总碱性磷酸酶水平显著升高,胰岛素治疗后其值降低；（5）、血清钙、磷水平在三组间没有显著差异。通过细胞分子水平的研究,进一步阐明胰岛素通过激活MAPK通路上调Osx和IGF-1的表达以及激活PI3K通路下调Runx2的表达促进成骨细胞生长、生存和分化成熟的分子机制。采用人成骨样MG-63细胞,胰岛素刺激或者胰岛素刺激的同时分别加入特异性的阻断剂阻断PI3K通路和MAPK通路,结果显示：胰岛素上调成骨细胞表面胰岛素受体的表达,并呈时间依赖性；胰岛素能促进成骨细胞的增殖、生存；增加碱性磷酸酶的活性和1型胶原蛋白的分泌；促进钙化结节的产生；上调Osx、IGF-1、OC和BMP-2的表达,下调Runx2的表达。阻断PI3K通路后,成骨细胞的增殖受到抑制并发生明显的凋亡,碱性磷酸酶的活性和1型胶原蛋白的分泌、钙化结节的产生、OC的表达都受到明显抑制,但Runx2的表达明显增加。阻断MAPK通路也能抑制成骨细胞的增殖和生存,碱性磷酸酶的活性和1型胶原蛋白的分泌、钙化结节的产生、OC的表达受到明显抑制,同时,Osx、IGF-1的表达明显降低,BMP-2的表达也有所降低。因此,胰岛素通过上调成骨细胞表面胰岛素受体的表达,激活PI3K通路下调Runx2的表达,而激活MAPK通路上调Osx和IGF-1的表达,从而促进成骨细胞生长、生存和分化成熟。此外,首次运用同步辐射X射线荧光探针技术（SRXRF）报道了鹿茸血通过提高Ca、P和Zn等骨矿元素水平,缓解去势大鼠骨质疏松的作用机制。结果表明：当大鼠去势后导致骨质疏松时,其股骨的BMD明显降低,则股骨元素Ca、P、Zn和Sr的相对强度也都降低,说明由于Ca和P等元素的大量丢失,引起骨质疏松。当鹿茸血治疗后,其骨组织中Ca、P及微量元素Zn的相对强度都有不同程度的升高,因而,BMD也显著升高,骨质疏松得到显著恢复。因此,鹿茸血可以通过改善骨组织Ca、P和Zn元素的含量达到抗骨质疏松的作用。接着,报道了鹿茸血通过提高血清睾酮和IGF-1的水平,使BMD得到增加,缓解骨质疏松的生物学效应机制。研究表明：去势导致E2的缺乏,伴随血清睾酮、IGF-1水平的降低,致使股骨和椎骨的BMD降低,引发骨质疏松。然而,鹿茸血治疗后,通过提高血清睾酮和IGF-1的水平,使股骨和椎骨的BMD得到增加,具有抗骨质疏松效应。但是,鹿茸血缓解骨质疏松的分子机制仍需进一步的研究。

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摘要

Abstract

第一章绪论

1.1 骨质疏松概述

1.2 成骨细胞

1.2.1 成骨细胞的生长、分化及成熟

1.2.2 成骨细胞分化相关蛋白的表达

1.2.3 成骨细胞分化相关的转录因子

1.2.3.1 Runx2与成骨细胞分化

SX与成骨细胞分化'>1.2.3.2 O_SX与成骨细胞分化

1.2.4 成骨细胞生长分化调节因子及信号通路

1.2.4.1 IGF-1

1.2.4.2 BMP-2

1.3 性激素与骨质疏松

1.3.1 雌性激素

1.3.2 雄性激素

1.4 糖尿病与骨质疏松

1.4.1 胰岛素

1.5 骨矿元素与骨质疏松

1.6 本文研究目的、意义和主要内容

1.6.1 研究目的和意义

1.6.2 主要内容

第二章 STZ诱导糖尿病大鼠股骨骨矿元素分析

2.1 摘要

2.2 前言

2.3 材料和方法

2.4 结果

2.5 讨论

第三章胰岛素治疗STZ诱导糖尿病大鼠股骨骨矿元素分析

3.1 摘要

3.2 前言

3.3 材料与方法

3.4 结果

3.5 讨论

第四章胰岛素治疗STZ诱导糖尿病大鼠骨质疏松实验研究

4.1 摘要

4.2 前言

4.3 材料与方法

4.4 结果

4.5 讨论

第五章胰岛素促进成骨样MG-63细胞生长及分化的分子机制研究

5.1 摘要

5.2 前言

5.3 材料与方法

5.4 结果

5.5 讨论

第六章鹿茸血处理去势大鼠股骨骨矿元素分析

6.1 摘要

6.2 引言

6.3 材料和方法

6.4 结果与讨论

6.5 结论

第七章鹿茸血治疗去势大鼠骨质疏松的实验研究

7.1 摘要

7.2 引言

7.3 材料与方法

7.4 结果

7.5 讨论

第八章结论

参考文献

致谢

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