论文摘要
第一部分小分子dsRNA介导的大鼠肝细胞系BRL中诱导型一氧化氮合酶基因表达上调的实验研究【目的】应用RNA激活技术激活大鼠肝细胞系BRL中诱导型一氧化氮合酶基因的表达,筛选出有效的激活序列,进一步证明了该现象普遍存在于哺乳动物细胞中【方法】在Ensemble基因库里找到大鼠iNOS基因的启动子序列，然后在dbTSS（http://dbtss.hgc.jp）,AceView（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/Research/Acembly）和UCSC（http://genome.ucsc.edu）基因数据库中分析启动子区域需要剔除的基因序列，确定基因转录起始位点。将iNOS启动子靶序列输入根据RNA激活原则设计的软件中,设计并化学合成了3条靶向大鼠iNOS基因启动子DNA序列互补的双链RNA分子以及1条阴性对照（?）（saRNA-1,saRNA-2,saRNA-3以及saRNA-control）采用脂质体法lipofectamineTM2000转染入大鼠肝细胞系BRL。转染后72h收集转染的细胞,采用RT-PCR法,Western-blot法检测细胞内iNOS的mRNA和蛋白的表达【结果】大鼠肝细胞系BRL转染羟基荧光素（FAM）标记的saRNA后，70%以上细胞内有绿色荧光表达。在细胞转染72h后采用半定量RT-PCR和Western-blot检测显示，saRNA-2转染后能够激活大鼠肝细胞系BRL内诱导型一氧化氮合酶基因的mRNA和蛋白的表达,其他saRNA转染后均未见激活现象【结论】利用RNA激活技术可成功激活大鼠肝细胞BRL细胞株iNOS基因的表达并为应用RNA激活技术打下实验基础。【目的】构建携带增强型绿色荧光蛋白基因（?）（EGFP）标记针对大鼠诱导型一氧化氮合酶基因的shRNA重组腺病毒载体并在人胚肾-293细胞中扩增制备重组腺病毒【方法】根据前期研究得到的靶向大鼠iNOS基因启动子序列并有激活作用的的saRNA-2,设计并合成shRNA寡核苷酸片段。将其退火后形成双链并克隆进入穿梭质粒pDC316-EGFP-U6中,构建重组质粒,并进行PCR鉴定,酶切鉴定以及测序分析。利用AdMax腺病毒包装系统，将构建好的带有EGFP标记基因的穿梭质粒pDC316-iNOS-shRNA-EGFP载体，与骨架质粒pBHGloxE1,3Cre同时转染人胚肾-293细胞，经过同源重组得到复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5-iNOS-shRNA-EGFP。再进一步将此病毒感染293细胞进行病毒扩增，采用离子交换法纯化病毒并检测纯化后病毒滴度及颗粒数。【结果】经聚合酶链反应（PCR）检测，限制性酶切分析及测序测定，证明已成功构建了重组穿梭质粒pDC316-iNOS-shRNA-EGFP和重组腺病毒载体Ad5-iNOS-shRNA-EGFP:（?）将重组腺病毒扩增纯化后检测病毒颗粒数为3.6×10 11VP/ml,A260/A280值约为1.25,病毒活性为7.94×10 9IU/ml。【结论】已成功构建重组腺病毒载体Ad5-iNOS-shRNA-EGFP,纯化病毒液量和滴度符合体内体外基因转染实验要求,为利用基因激活技术治疗勃起功能障碍的研究奠定了基础。第三部分腺病毒介导的shRNA上调大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞iNOS表达激活NO/cGMP通路的实验研究【目的】探讨靶向大鼠iNOS基因的shRNA重组腺病毒载体对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞iNOS基因的激活作用，为阴茎勃起功能障碍（ED）的基因治疗提供实验依据【方法】将前期构建的重组腺病毒Ad5-iNOS-shRNA-EGFP（AdU6/shiNOS）和对照病毒AdU6/shControl,分别转染大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,分别在不同病毒MOI（25,50,75）值下72小时后采样检测。采用realtime RT-PCR半定量检测AdU6/shiNOS对细胞iNOS基因mRNA表达影响；western-blot法检测海绵体平滑肌细胞iNOS蛋白表达变化。然后培养基中加L-Arg（10mmol/L）,用酶联免疫法检测病毒转染72h后海绵体平滑肌细胞内cGMP的浓度变化,记录AdU6/shiNOS对平滑肌细胞内cGMP的影响。【结果】AdU6/shiNOS转染大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞72小时后,和空白对照组、阴性对照组相比iNOS基因在mRNA和蛋白表达水平均显著上调（P<0.05）,呈剂量依赖性，MOI-75时RNAa效果最好。而且转染72h后，实验组原代平滑肌细胞内cGMP水平显著高于对照组及空白组（P<0.05）【结论】利用腺病毒介导的RNAa技术，提高海绵体平滑肌细胞iNOS基因表达获得成功,可以增加阴茎海绵体平滑肌细胞cGMP水平，激活了NO/cGMP通路,这为勃起功能障碍的基因治疗研究开辟了新的方向。
论文目录
相关论文文献
- [1].单用他达拉非及联用硫辛酸治疗2型糖尿病性ED的比较[J]. 中国男科学杂志 2020(01)
- [2].不同倍数ED_(95)顺式阿曲库铵在老年患者全麻诱导中应用分析[J]. 现代中西医结合杂志 2017(23)
- [3].口腔矫正器联合他达拉非治疗重度阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征合并ED的疗效分析[J]. 中华男科学杂志 2016(09)
- [4].男人对ED的认识存在三大误区[J]. 黄河.黄土.黄种人 2016(21)
- [5].熟读顺口溜,识记-ed过去式发音规则[J]. 小学教学设计 2017(12)
- [6].经鼻纤维支气管镜气管插管时舒芬太尼ED_(50)[J]. 临床麻醉学杂志 2013(10)
- [7].不同剂量右美托咪定对依托咪酯致患者意识消失ED_(95)的影响[J]. 临床麻醉学杂志 2019(12)
- [8].他达拉非治疗合并心血管疾病的ED研究进展[J]. 中华男科学杂志 2013(09)
- [9].西地那非的抗非ED研究[J]. 当代医学 2011(02)
- [10].左归丸治疗Ⅲ型前列腺炎合并ED患者60例[J]. 陕西中医学院学报 2011(06)
- [11].伐地那非治疗ED的有效性及安全性研究[J]. 中华男科学杂志 2011(12)
- [12].一例糖尿病ED患者可膨胀性三件套阴茎假体植入术的护理体会[J]. 云南医药 2020(04)
- [13].疏肝益阳胶囊治疗低睾酮血症所致ED的临床效果观察[J]. 临床合理用药杂志 2016(07)
- [14].睾酮替代治疗雄激素缺乏ED患者65个月1例报告及文献复习[J]. 中华男科学杂志 2014(02)
- [15].联合应用顺阿曲库铵与维库溴铵后ED_(50)和ED_(95)的改变[J]. 中国当代医药 2014(24)
- [16].如何使万艾可更有效的治疗老年性功能障碍(ED)患者(附143例临床观察)[J]. 现代生物医学进展 2010(10)
- [17].全麻诱导时七氟醚ED_(50)值及咪唑安定对其影响[J]. 江苏医药 2010(20)
- [18].他达拉非治疗ED疗效和安全性新进展[J]. 中华男科学杂志 2009(10)
- [19].他达拉非治疗ED的概述[J]. 中华男科学杂志 2013(04)
- [20].持续小剂量口服他达拉非治疗ED的疗效观察[J]. 中国男科学杂志 2009(03)
- [21].长期服用苯妥英钠对罗库溴铵ED_(95)的影响[J]. 中国实用医药 2009(35)
- [22].男同性恋者婚内ED的调查[J]. 中国性科学 2008(03)
- [23].他达拉非:ED患者及其配偶的选择偏爱?[J]. 中华男科学杂志 2008(07)
- [24].长期口服小剂量伐地那非治疗按需服药无效ED的疗效观察[J]. 临床泌尿外科杂志 2008(06)
- [25].可控性阴茎假体植入术治疗根治性前列腺切除术后ED的护理体会[J]. 现代医学 2015(07)
- [26].他达拉非半量隔日口服治疗ED的疗效观察[J]. 东南大学学报(医学版) 2012(02)
- [27].小肠ED导管在小儿术后早期炎性肠梗阻的应用价值[J]. 山西医科大学学报 2011(06)
- [28].瑞芬太尼对小儿插入喉罩丙泊酚ED_(50)的影响[J]. 临床麻醉学杂志 2011(07)
- [29].按体表面积给药维库溴胺ED_(95)的测定[J]. 广东医学 2010(12)
- [30].脑电双频指数在老年支气管镜检查咪唑安定ED_(50)计算中的应用[J]. 中国实用医药 2009(27)
标签：诱导型论文; 氧化氮合酶论文; 激活论文; 肝细胞论文; 大鼠论文; 氧化氮全酶论文; 腺病毒载体论文; 增强型绿色荧光蛋白论文; 勃起功能障碍论文; 基因治疗论文; 基因论文;