（南京军区南京总医院制剂科江苏南京210002）
【摘要】本研究通过二硫键断裂试剂β-巯基乙醇制备白蛋白纳米制剂。结果表明：巯基乙醇的加入导致白蛋白结构变化和疏水核心的暴露，促进纳米粒子的形成。白蛋白纳米粒可聚集于荷瘤小鼠肿瘤组织中。因此，白蛋白纳米粒子是药理活性物质靶向输送的理想载体。
【中图分类号】R619【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）32-0183-02
1.背景
药物传递系统可以通过靶向作用显著提高抗肿瘤药物疗效和治疗指数[1]。内源性血浆蛋白作为药物载体的潜在应用已被广泛研究。最有希望的载体是人血清白蛋白（HSA）[2]，具有许多优点。首先，表面羧基和氨基基团可以用于药物偶联[3]；第二、生物相容性好；第三、具有被动靶向和gp60受体介导主动靶向肿瘤[4]。因此，HSA是一种理想的药理活性物质的载体。
本研究中，我们用β-巯基乙醇的二硫键断裂法制备尺寸可控的白蛋白纳米粒。透射电子显微镜（TEM）和疏水性方法评价纳米粒子的形态和分子聚集过程，用荷瘤小鼠进行粒子靶向性评价。
2.实验
2.1材料
人血清白蛋白，近红外-797，β-巯基乙醇购自Sigma（美国），其余试剂均为国产试剂。
2.2白蛋白粒子的制备、形态观察及荧光光谱
100毫克的HSA溶于10mLTris缓冲液（0.5mm）。37℃缓慢搅拌，并加入900μLβ-巯基乙醇。2,4和6min后，用90plus粒度分析仪测定了粒子的尺寸。溶液滴在200目镀碳膜铜网上，用JEOL（JEM—2100，Japan）显微镜观察。6min制备的样品点样于玻璃片上，光学显微镜观察。
2.3表面疏水性测量
150μLβ-巯基乙醇加到100mg白蛋白溶液中。2,4,和6min后，取出2mL溶液，加入20μL终浓度为3mm的ANS。用Rf-5301pc（岛津，日本）荧光分光光度法测定该混合物的荧光光谱。激发和发射波长分别为390nm,400～650nm。
2.4体内成像
白蛋白（30mg）溶解在3mL（5mMTris缓冲液，pH值7.8），加入3mgNIR-797（300μL二甲亚砜为溶剂）,37℃搅拌2h。用于制备白蛋白纳米粒。将NIR-797白蛋白纳米粒子（4mg）尾静脉注射S180荷瘤小鼠（ICR，30～32g），MaestroDynamicTM成像仪（CRI，Woburn，MA）观察肿瘤部位成像。发射波长为800～900nm，曝光时间为2s。静脉注射后2,8，30和108h,活体成像并处理小鼠，分离各脏器观察。
3.结果与讨论
3.1白蛋白纳米粒子的制备和光谱变化
β-巯基乙醇为二硫键断裂试剂，加入白蛋白溶液后，溶液逐渐变成蓝色。DLS检测2，4，6分钟制备的粒子，发现纳米颗粒的大小逐渐增加（图1）。小尺寸的颗粒分布较窄，而大的粒子趋向于多分散。透射电子显微镜（TEM）和光学成像（图2），β-巯基乙醇制备的白蛋白纳米粒为球状或不规则形状，大小与DLS检测一致。
图1.pH7.8条件下，不同时间制备的白蛋白粒子粒径分布a)2;b)4;c)6min
.
如图3所示，组装过程中白蛋白纳米粒的疏水性表面与游离状态相比，疏水性表面逐渐降低。蛋白质疏水性核心的暴露是引发组装的必不可少的因素[5]。
3.2白蛋白纳米粒子体外和体内靶向
在NIR-797白蛋白纳米颗粒的肿瘤成像研究（～150nm）中，我们发现静脉注射纳米粒子8h后腹部高摄取，而30h后，只有微弱的积累。8～30h时，纳米粒子肿瘤部位积累，在108h达到高锋（图6）。结果表明，白蛋白纳米粒具有对肿瘤组织被动滞留效应[4]和靶向在肿瘤细胞GP60和SPARC受体高表达的主动性[6]。因此，白蛋白可以通过偶联、非共价结合某些亲水性和疏水性药物、过渡金属药物和生物成像探针，再组装成纳米粒子。以这种方式制备的白蛋白纳米粒可靶向肿瘤组织，同时增加了临床药物药效对降低正常组织的系统毒性。
图6.荷瘤小鼠静脉注射NIR-797标记白蛋白粒子成像图，a)2,8,30,108h活体成像；b)小鼠脏器在108h离体成像。
4.结论
研究表明，可使用β-巯基乙醇法获取50～2000nm的白蛋白纳米粒。疏水作用、离子键等作用可能在白蛋白纳米粒子的形成中起了关键性作用。白蛋白纳米粒子对肿瘤组织具有被动或主动靶向作用。纳米颗粒对肿瘤细胞无毒。因此，通过二硫键断裂法制备的白蛋白纳米粒子是很有希望的纳米载体。
【参考文献】
[1]P.Couvreur,C.Vauthier,Nanotechnology:intelligentdesigntotreatcomplexdisease,PharmRes,23(2006)1417-1450.
[2]L.Yang,F.Cui,D.Cun,A.Tao,K.Shi,W.Lin,Preparation,characterizationandbiodistributionofthelactoneformof10-hydroxycamptothecin(HCPT)-loadedbovineserumalbumin(BSA)nanoparticles,IntJPharm,340(2007)163-172.
[3]S.J.Mao,S.X.Hou,R.He,L.K.Zhang,D.P.Wei,Y.Q.Bi,H.Jin,Uptakeofalbuminnanoparticlesurfacemodifiedwithglycyrrhizinbyprimaryculturedrathepatocytes,WorldJGastroenterol,11(2005)3075-3079.
[4]H.Maeda,J.Wu,T.Sawa,Y.Matsumura,K.Hori,TumorvascularpermeabilityandtheEPReffectinmacromoleculartherapeutics:areview,JControlRelease,65(2000)271-284.
[5]A.Okuno,M.Kato,Y.Taniguchi,Thesecondarystructureofpressure-andtemperature-inducedaggregatesofequineserumalbuminstudiedbyFT-IRspectroscopy,BiochimBiophysActa,1764(2006)1407-1412.
[6]N.Desai,V.Trieu,B.Damascelli,P.Soon-Shiong,SPARCExpressionCorrelateswithTumorResponsetoAlbumin-BoundPaclitaxelinHeadandNeckCancerPatients,TranslOncol,2(2009)59-64.
致谢：南京军区南京总医院院管课题（编号2013055）对本课题研究的支持。