论文摘要
背景与目的原发性肝癌（primary human hepatocellular carcinoma, HCC）是消化道常见恶性肿瘤之一,其发病率为癌症中第五位,死亡率占第三位,已成为危害人类健康的主要疾病。HCC术后五年生存率仅为30%～60%,早期肝癌难以诊断,是导致其预后差的主要原因。外周血中甲胎蛋白（AFP）作为原发性肝癌的诊断指标被普遍使用,但并非所有的原发性肝癌患者都呈现AFP升高,有30%-40%左右患者（特别是小肝癌）的AFP呈阴性或低浓度,同时也有部分肝炎或肝硬化患者的AFP升高。因此仅用外周血的AFP作为筛查指标,极有可能造成漏诊和误诊,所以急需寻找一种新的、更特异的诊断方法。DNA甲基化是一种重要转录调控机制,并与肿瘤发生有着密切的联系。肿瘤相关基因异常甲基化是细胞癌变过程中的一个早期、频发事件,在肿瘤的发生和发展中起重要作用,检测某些抑癌基因的甲基化状态对早期诊断和预测肿瘤发生有重要意义。对特异基因CpG岛甲基化模式的研究可以从全新的角度阐明肝癌发生发展的分子机制。寻找肝癌的基因甲基化谱,并将其用于早期诊断、多重耐药基因（multi-drug resistance, MDR）监测,以选择合适的治疗方案,使患者得到个性化治疗,提高疗效是今后的研究重点之一。已有研究表明：Oct6基因异常甲基化与非小细胞肺癌的肿瘤细胞分化程度密切相关；sall3基因CpG岛甲基化状态的检测有望成为膀胱癌早期诊断的分子靶标。还有人用甲基化定性方法证实Oct6基因和sall3基因的CpG岛在肝癌组织发生甲基化的频率高于癌旁组织。由此推测Oct6和sall3的异常甲基化很可能与肝癌发病相关。Oct6和sall3作为肝癌甲基化谱的两个新标靶,目前国内外尚无它们在肝癌的甲基化定量、mRNA表达水平、转录调控机制、异常甲基化临床意义的相关研究。本实验用MassArray技术平台定量检测38例肝癌组织和癌旁组织中Oct6和sall3的CpG岛甲基化水平；用荧光定量PCR检测38例肝癌组织和癌旁组织中Oct6和sall3的mRNA表达水平,以探讨基因CpG岛甲基化水平与mRNA表达水平的相关性。通过检测0.1、0.5、2.5μM去甲基化药5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-CdR）对HepG2、Huh7、SMMC7721、Be17402、SK-HEP1和QGY7703细胞株中基因甲基化水平及mRNA表达水平的影响来进一步验证Oct6和sall3的CpG岛甲基化是其mRNA表达的一种调控机制。本文还探讨了基因甲基化水平与性别、年龄、肿瘤细胞分化程度及HBV感染的关系,为其异常甲基化的临床意义提供了初步理论依据。材料与方法1.研究对象38例肝癌组织及相应癌旁组织（16例从南方医院肝胆外科收集,22例由中山大学肿瘤医院惠赠）。肝癌细胞株HepG2、Huh7、SMMC7721、Be17402、SK-HEP1和QGY7703购自中国科学院上海细胞所,以含10%胎牛血清的DMEM （Dulbecco’s modified Eagle’s medium）培养基于37℃、5%CO2的培养箱中培养。2.5-氮-2’-脱氧胞苷处理肝癌细胞株取指数增长期的细胞株接种于6孔板,培养24 h后,分别添加含有终浓度为0、0.1、0.5、2.5μM 5-Aza-CdR的培养液,每天换液一次,培养3天。3.DNA甲基化水平检测应用全基因组提取试剂盒抽提组织和细胞株的基因组DNA,经亚硫酸盐处理,应用MassArray（?）piTYPER技术平台（Sequenom公司）检测38例肝癌组织、癌旁组织、6种肝癌细胞株（5-Aza-CdR处理组和对照组）中Oct6和sall3的CpG岛甲基化水平。4. mRNA表达水平检测为了研究38例肝癌组织、癌旁组织、6种肝癌细胞株（5-Aza-CdR处理组和对照组）中Oct6和sall3的mRNA表达水平,我们应用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测基因表达水平。β-actin作为内参基因对RNA含量的变异进行较正,每种样品均进行3次独立重复实验。采用扩增倍数（2△△Ct）表示Oct6和sall3的mRNA相对表达量,扩增倍数＝2（ct对照组目的基因Ct对照组β-actin）-（ct处理组目的基因-ct处理纽β-actin）。5.甲基化水平和表达水平的关联分析用Spearman检验分析肝癌病例中目的基因的CpG岛甲基化水平与转录水平的相关性,统计检验均为双侧概率检验,选取检验水准为α=0.05,数据采用SPSS13.0软件分析。6.甲基化水平在不同组的差异分析用Wilcox rank sum检验分析目的基因CpG岛甲基化水平在肝癌组织和癌旁组织的差异及在不同性别、年龄、HBV感染的差异。用Kruskal-Wallis检验分析目的基因CpG岛甲基化水平在3种不同肿瘤细胞分化程度的差异。所有的统计检验均为双侧概率检验,选取检验水准为α=0.05,数据采用SPSS 13.0软件分析。结果1.1肝癌组织和癌旁组织中Oct6的CpG岛甲基化水平及转录水平的研究1.1.1 Oct6 CpG岛在肝癌组织和癌旁组织的甲基化水平47.3%（18/38）癌组织的Oct6 CpG岛甲基化水平高于癌旁组织,癌组织在每个CG单位的平均甲基化水平比癌旁组织高14%-26%；52.7%（20/38）癌组织的Oct6 CpG岛甲基化水平与癌旁组织相当。1.1.2 Oct6在肝癌组织和癌旁组织的转录水平81.6%（31/38）癌组织的Oct6 mRNA表达水平低于癌旁组织；5.3%（2/38）癌组织的Oct6 mRNA表达水平高于癌旁组织；13.1%（5/38）癌组织的Oct6 mRNA表达水平与癌旁组织相当。1.1.3 Oct6的CpG岛甲基化水平与转录水平的相关性分析Oct6 mRNA表达水平低于癌旁组织的31例癌组织中,17例癌组织的Oct6CpG岛甲基化水平高于癌旁组织,并且甲基化水平与mRNA表达水平存在负相关（rs=-0.789,P<0.001）；14例癌组织的Oct6 CpG岛甲基化水平与癌旁组织相当。在剩余的7例组织中,1例癌组织中Oct6的mRNA表达水平及CpG岛甲基化水平高于癌旁组织；1例癌组织中Oct6的mRNA表达水平高于癌旁组织、CpG岛甲基化水平与癌旁组织相当；5例癌组织中Oct6的mRNA表达水平及CpG岛甲基化水平与癌旁组织相当。1.2 5-Aza-CdR对肝癌细胞株中Oct6的CpG岛甲基化水平及转录水平的影响为了进一步证实DNA甲基化是Oct6在肝癌的一种转录调控机制。我们研究去甲基化药是否能通过下调CpG岛的高甲基化状态而上调mRNA的表达水平。通过0.1、0.5、2.5μM去甲基化药5-Aza-CdR作用后,Huh7和Bel7402细胞株中Oct6的CpG岛甲基化水平呈药物浓度依赖性下降、mRNA表达水平呈药物浓度依赖性上升；SK-HEP1和QGY7703细胞株中Oct6的CpG岛甲基化水平呈药物浓度依赖性下降、mRNA表达水平有不同程度上升；SMMC7721细胞株中Oct6的CpG岛甲基化水平呈药物浓度依赖性下降、mRNA表达水平无明显变化。在HepG2细胞株,Oct6 CpG岛中许多CG单位的甲基化水平<20%；5-Aza-CdR作用后,甲基化水平轻微下降、mRNA表达水平轻微上升。1.3 Oct6 CpG岛在不同临床资料分组的甲基化水平女性组的Oct6 CpG岛甲基化水平高于男性组,5个CG单位在两组的甲基化水平差异达到统计学意义；>48岁组的Oct6 CpG岛甲基化水平高于≤48岁组,6个CG单位在两组的甲基化水平差异达到统计学意义；HBV阴性组的Oct6CpG岛甲基化水平高于HBV阳性组,6个CG单位在两组的甲基化水平差异达到统计学意义；Oct6 CpG岛甲基化水平与肿瘤细胞分化程度无明显相关。2.1肝癌组织和癌旁组织中sall3的CpG岛甲基化水平及转录水平的研究2.1.1 sall3岛在肝癌组织和癌旁组织的甲基化水平71%（27/38）癌组织的sall3 CpG岛甲基化水平高于癌旁组织,癌组织在每个CG单位的平均甲基化水平比癌旁组织高15%～37%；29%（11/38）癌组织的sall3 CpG甲基化水平与癌旁组织相当。2.1.2 sall3在肝癌组织和癌旁组织的转录水平86.8%（33/38）癌组织的sall3 mRNA表达水平低于癌旁组织；7.9%（3/38）癌组织的sall3 mRNA表达水平高于癌旁组织；5.3%（2/38）癌组织的sall3 mRNA表达水平与癌旁组织相当。2.1.3 sall3的CpG岛甲基化水平与转录水平的相关性分析sall3 mRNA表达水平低于癌旁组织的33例癌组织中,24例癌组织的sall3CpG岛甲基化水平高于癌旁组织,并且甲基化水平与mRNA表达水平存在负相关（rs=-0.714,P<0.001）；9例癌组织的sall3 CpG岛甲基化水平与癌旁组织相当。剩余的5例组织中,1例癌组织sall3的mRNA表达水平高于癌旁组织、CpG岛甲基化水平与癌旁组织相当；2例癌组织中sall3的mRNA表达水平及CpG岛甲基化水平高于癌旁组织；1例癌组织中sall3的mRNA表达水平及甲基化水平与癌旁组织相当；1例癌组织中sall3的mRNA表达水平与癌旁组织相当、CpG岛甲基化水平高于癌旁组织。2.2 5-Aza-CdR对肝癌细胞株中sall3的CpG岛甲基化水平及转录水平的影响通过0.1、0.5、2.5μM去甲基化药5-Aza-CdR作用后,Huh7、HepG2.SK-HEP1和SMMC7721细胞株中sall3的CpG岛甲基化水平呈药物浓度依赖性下降、mRNA表达水平呈药物浓度依赖性上升；Bel7402和QGY7703中sall3的CpG甲基化水平呈浓度依赖性下降、mRNA表达水平有不同程度上升。2.3 sall3 CpG岛在不同临床资料分组的甲基化水平女性组的sall3 CpG岛甲基化水平高于男性组,3个CG单位在两组的甲基化水平差异达到统计学意义；>48岁组的sall3 CpG岛甲基化水平高于≤48岁组,2个CG单位在两组的甲基化水平差异达到统计学意义；HBV阴性组的sall3CpG岛甲基化水平高于HBV阳性组,但24个CG单位在两组的甲基化水平差异均未达到统计学意义；虽然癌组织中CpG岛的大多数CG单位都表现为随着肿瘤细胞分化越差其甲基化水平越高,但是多数未达到统计学意义。结论1.38例肝癌病例中,18例癌组织的Oct6 CpG岛甲基化水平高于癌旁组织。在这18例中,17例癌组织的Oct6 mRNA表达水平低于癌旁组织,并且其甲基化水平与mRNA表达水平存在负相关（rs=-0.789,P<0.001）。去甲基化药5-Aza-CdR处理HepG2、Huh7、SMMC7721、Be17402、SK-HEP1和QGY7703细胞株后,除SMMC7721细胞株外,其余5种肝癌细胞株中Oct6的CpG岛甲基化水平下调而mRNA表达水平上调。以上结果表明DNA甲基化是Oct6在肝癌的一种重要转录调控机制。2.38例肝癌病例中,14例癌组织的Oct6 mRNA表达水平低于癌旁组织,但其CpG岛甲基化水平与癌旁组织相当；5-Aza-CdR处理SMMC7721细胞株后,Oct6的CpG岛甲基化水平下调而mRNA表达水平无明显变化。以上结果表明Oct6在肝癌存在其它转录调控机制。3.38例肝癌病例中,27例癌组织的sall3 CpG岛甲基化水平高于癌旁组织。在这27例中,24例癌组织的sall3 mRNA表达水平低于癌旁组织,并且其甲基化水平与mRNA表达水平存在负相关（rs=-0.714,P<0.001）。去甲基化药5-Aza-CdR处理HepG2、Huh7、SMMC7721、Bel7402、SK-HEP1和QGY7703细胞株后,6种肝癌细胞株中sall3的CpG岛甲基化水平都下调而mRNA表达水平都上调。以上结果表明DNA甲基化是sall3在肝癌的一种重要转录调控机制。4.38例肝癌病例中,9例癌组织的sall3 mRNA表达水平低于癌旁组织,但其CpG岛甲基化水平与癌旁组织相当。表明sall3在肝癌存在其它转录调控机制。