乳癌细胞系的DARC表达的调节机制以及患者Duffy血型与病理关系的研究

论文摘要

[目的]DARC是Duffy抗原/趋化因子受体（Duffy antigen/Receptor 0fChemokine）的简称。Duffy抗原和DARC是有同样结构和功能的蛋白质分子,它们的区别仅仅在于Duffy抗原位于红细胞上,而DARC位于乳腺癌细胞等其它非红细胞上。Duffy抗原决定了Duffy血型。DARC是乳腺癌的负性调控因子,它和乳腺癌关系密切;另外,已知炎症性疾病时DARC上调。因此,我们提出TNF-α等致炎性细胞因子调节乳腺癌细胞DARC表达的假设并加以验证。在患者Duffy血型与临床病理关系的研究方面,目的是验证Duffy血型（Duffy Blood Group,DBG）的表型是否与乳腺癌的发生和恶性程度有关。相关的研究背景包括:流行病学的研究表明,不同民族有不同的DBG表型分布,同时,不同民族在乳腺癌的发病率和死亡率方面也有所不同。【方法】选择常见的四种致炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ和IL-8,以乳腺癌MDA-MB-231细胞系为研究对象,应用Real-Time PCR和Western-Blot方法,检测这些致炎性细胞因子能否调节MDA-MB-231的DARC表达。在初步验证TNF-α可以上调DARC的表达κ之后,进一步检测TNF-α抗体和NF-κB（nuclear factor-kappaB,核转录因子κB）抑制剂AEA（anadmide,NF-κB阻滞剂）对于DARC表达的影响。本实验还采用ELISA定量内源性TNF-α的浓度,确定内源性TNF-α对DARC表达的影响。最后应用Transwell观察TNF-α上调乳腺癌细胞系DARC表达后,细胞对于趋化因子CXCL8、CCL2的清除能力、细胞的趋化运动、侵袭能力是否改变以确定DARC的这种上调是否具有功能。在Duffy血型与临床病理关系的研究方面,我们采用了非直接抗人球蛋白法检验了复旦大学附属上海肿瘤医院乳腺科的连续253例女性病人的DBG表型,根据凝血情况分为Fya+Fyb-、Fya-Fvb+、Fya+Fyb+和Fya-Fyb-四种表型。在此基础上分析DBG表型与病理之间的关系。【结果】0.5～1ng/ml的TNF-α上调mDARC4～8倍。4～8ng/ml的IL-1β可以上调DARC 7倍左右。IFN-γ和IL-8对DARC表达的影响较小。应用TNF-α抗体后,TNF-α上调DARC的作用减弱。DARC的上调或下调时,其mRNA和蛋白的变化是同步的。AEA25μM作用后,TNF-α上调DARC的作用降低。内源性TNF-α对DARC表达没有显著影响。TNF-α上调乳腺癌细胞系的DARC表达后,细胞对于趋化因子CXCL8、CCL2的清除能力提高了,同时提高了细胞对于CXCL8、CCL2的趋化运动,并且降低了细胞的侵袭运动能力。在Duffy血型与病理关系的研究方面,我们发现有乳腺疾病或有乳腺癌的汉族女性患者和普通汉族人群在DBG表型分布方面的差异无显著性。在乳腺癌的发病方面,Fya-Fyb-和Fya-Fyb+有更高的乳腺癌的发病倾向性,但没有统计学的差异;Fya-表型的患者群和Fya+表型的患者群相比有更高的恶性率,但没有统计学的差异（两者分别为57.14%和39.02%,P=0.28）。各表型之间在ER、PR、Her-2、P53、PCNA、PS2、nm23和P450状态方面没有差异;在乳腺癌的病理分级方面也没有统计学差异。表型Fya-的患者比Fya+的患者有更高的腋淋巴结转移率（分别是100%和39.13%,P＜0.05,FisHer精确检验）。[结论]TYF-α和IL-1β对于DARC的表达起重要作用。TNF-α对DARC的调节可能通过NF-κB起作用。乳腺癌细胞系MDA-MB-231自身分泌的TNF-α对于DARC的调节功能并不重要。在Dufry血型与病理关系的研究方面,本研究表明,对于乳腺癌患者的腋淋巴结转移,Dufry血型表型体系中的Fya抗原比Fyb抗原更加重要。Fya-表型对于发现腋淋巴结转移的倾向的乳腺癌患者有帮助

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1.DARC和Duffy抗原的发现历史及命名
• 2.研究背景和假设的提出
• 3.研究途径和方法
• 4.研究意义
• 前言参考文献
• 第一部分、乳癌细胞系的DARC表达的调节机制研究
• 实验材料与方法
• 一.实验材料
• 1.细胞及培养
• 2.主要试剂
• 2.1.处理因素相关试剂
• 2.2.Real-Time PCR相关试剂
• 2.3.Western-Blot主要试剂
• 2.4.Western-Blot其它相关试剂
• 2.5.Transwell相关试剂
• 2.6.ELISA相关试剂
• 3.主要实验仪器
• 二.方法
• 1.细胞培养
• 2.Real-Time PCR
• 2.1.总RNA抽提
• 2.2.逆转录
• 2.3.Real-Time PCR
• 2.4.Real-Time PCR的质量控制
• 2.5.Real-Time PCR实验处理因素
• 3.Western Blot
• 3.1.细胞裂解液的收集
• 3.2.蛋白定量及浓度的调节
• 3.3.SDS-PAGE电泳
• 3.4.考马斯亮蓝染色
• 3.5.转膜
• 3.6.丽春红染色
• 3.7.封闭
• 3.8.免疫检测
• 3.9.ECL反应及曝光
• 3.10.洗脱抗体后再次行Western Blot检测
• 3.11.Western Blot实验的图像采集和分析
• 3.12.Western Blot实验的质量控制
• 3.13.Western Blot实验处理因素
• 4.Transwell
• 4.1.细胞上调DARC后细胞对于CCL2趋化运动的改变
• 4.2.细胞上调DARC后对于细胞侵袭性的影响
• 5.ELISA
• 5.1.ELISA基本原理
• 5.2.ELISA操作步骤
• 5.3.ELISA注意事项
• 6.统计方法
• 结果
• 1.TNF-α和IL-1β对于DARC调节作用较明显,IFN-γ和IL-8对于DARC表达的影响较弱
• 2.应用TNF-α抗体后,TNF-α上调DARC的作用减弱
• 3.AEA（NF-κB阻滞剂）25μM的终浓度作用后,TNF-α上调DARC表达作用降低
• 4.乳腺癌细胞系MDA-MB-231自身分泌的TNF-α对DARC表达没有显著影响
• 5.TNF-α上调乳腺癌细胞系的DARC表达后,提高了细胞对于CCL2的趋化运动,同时降低细胞的侵袭运动能力
• 6.TNF-α上调乳腺癌细胞系的DARC表达后,提高了细胞对于CXCL8、CCL2的清除能力
• 讨论
• 1.DARC的结构、功能、表达、以及与肿瘤的关系
• 2.本实验选择MDA-MB-231细胞系作为研究对象的原因
• 3.不同致炎性细胞因子对于DARC的调节作用不同
• 4.TNF-α抗体对TNF-α引起的DARC表达改变的影响
• 5.TNF-α对DARC的调节可能通过NF-κB起作用
• 6.内源性TNF-α对DARC表达的调节并不显著
• 7.DARC上调后,提高细胞对于CXCL8、CCL2的趋化运动和提高细胞清除趋化因子CXCL8、CCL2的能力,同时降低细胞的侵袭运动能力
• 8.对于DARC的调节机制研究,需要进一步考虑的问题
• 第二部分 患者的Duffy血型与病理关系的研究
• 材料和方法
• 一.材料
• 1.血液样本准备
• 2.主要试剂
• 二.方法
• 1.测定Duffy血型的原理
• 2.3～5%的红细胞悬液制作
• 3.非直接抗人球蛋白法检查Duffy血型的步骤及说明
• 4.乳腺疾病患者临床资料的收集整理及统计排除的说明
• 5.病理诊断方法
• 6.统计方法
• 结果
• 1.患者的病理诊断
• 2.乳腺疾病患者和乳腺癌患者的Duffy血型的表型分布
• 3.患者Duffy血型表型分布与乳腺疾病的良恶性、以及其它的临床病理参数的关系
• 4.表型Fya-的患者比Fya+的患者有更高的腋淋巴结转移率
• 讨论
• 1.DARC对于乳腺癌是一个负性调控因子
• 2.DARC在Fya+和Fya-表型的个体的红细胞表面的分布数目是不同的,其结合配体的能力也不同
• 3.为什么不同Duffy表型的个体有不同的腋淋巴结转移状况以及为什么Fya-个体比Fya+个体更易发生腋淋巴结转移?
• 结语
• 正文的参考文献
• 附录 综述:人乳腺癌的动物模型
• 综述的参考文献
• 研究生阶段发表论文与参加会议情况
• 致谢