酿酒酵母Pde1的细胞内定位与定位调控机制的研究

论文摘要

酿酒酵母本身具有两个编码环腺苷酸（cAMP）磷酸二酯酶的基因PDE1和PDE2。它们分别编码低亲和力的cAMP磷酸二脂酶Pde1和高亲和力的cAMP磷酸二脂酶Pde2。低亲和力磷酸二脂酶Pde1在由葡萄糖所诱导的酿酒酵母细胞cAMP信号反应过程中起反馈抑制的作用。Pde1的酶活性是受到PKA磷酸化调节的。但以往的研究发现:在胞外试验中,磷酸化纯化的Pde1并不能改变它对cAMP的低亲和力性或激活其降解cAMP的活性。因此,很可能磷酸化的作用在于使Pde1酶定位于胞内特定的位点,而cAMP趋向于在该位点被降解。本课题研究是先在大肠杆菌与酵母的穿梭质粒YCplac33的多克隆位点上构建PDE1与GFP（编码绿色荧光蛋白）融合基因。再将这一新构建质粒V410导入基因组PDE1基因缺失的菌株YN123、YN100和YN101。菌株YN123的PKA水平是组成型降低的;菌株YN100的PKA水平正常;菌株YN101的PKA水平是组成型升高的。将这些菌株在以甘油（非发酵性碳源）为碳源的合成培养基中培养至对数生长期时,加入葡萄糖诱导细胞。通过免疫荧光检测的方法,检测细胞内Pde1-GFP融合蛋白的细胞内定位。研究发现:生长在非发酵性碳源培养基中的菌株YN123和菌株YN100其Pde1蛋白定位在细胞质内,很有可能集中在内质网或高尔基体上。其中葡萄糖诱导菌株YN123之后,细胞内Pde1-GFP融合蛋白的定位没有明显地变化;葡萄糖诱导菌株YN100之后,细胞内的Pde1-GFP融合蛋白从集中于细胞质内特定的位点（内质网或高尔基体）扩散到细胞质中;而在葡萄糖诱导菌株YN101前后,Pde1-GFP融合蛋白均稳定在细胞质中。这一结果暗示在低PKA活力的细胞（细胞生长在非发酵性碳源培养基中或是胞内PKA水平组成型降低）中,未被磷酸化的Pde1会从细胞质中汇集到内质网或高尔基体上以防止其降解胞内的cAMP;另一方面,在高PKA活力的细胞（细胞生长在葡萄糖培养基中或胞内PKA水平组成型升高）中,Pde1将被磷酸化,并且定位于细胞质中水解cAMP。研究过程中同时发现:在葡萄糖诱导5分钟以后,Pde1-GFP融合蛋白以点状散布在细胞质内。这一现象与生长在非发酵型碳源培养基中的菌株YN123和菌株YN100细胞内Pde1-GFP融合蛋白定位情况类似。这就与先前研究成果相一致即:酵母细胞在葡萄糖上一旦开始发酵型生长,Ras-cAMP通路便会被关闭,另一通路FGM将会取代PKA的作用去激活PKA的目标蛋白。Sch9是目前唯一所知的FGM通路的组分,它对PKA的活力有抑制作用。因此,葡萄糖的加入激活了FGM通路,导致PKA活力的降低,Pde1磷酸化水平下降。研究过程中发现:在已经出芽的酿酒酵母细胞中,Pde1更加集中于芽,并且在芽中则趋向于集中到芽生长位点的顶部。这暗示:Pde1趋向于集中到细胞生长

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 细胞信号转导概述
• 1.1.1 引言
• 1.1.2 跨膜信号转导
• 1.1.3 细胞表面受体的跨膜信号转换
• 1.1.4 G 蛋白与跨膜细胞信号转导
• 1.2 Ras-cAMP 信号通路
• 1.2.1 cAMP 的发现及第二信使学说的提出
• 1.2.2 Ras-cAMP 信号通路组成
• 1.2.2.1 Ras 蛋白
• 1.2.2.2 Cdc25 和Sdc25
• 1.2.2.3 Ira1 和Ira2
• 1.2.2.4 Cdc35/Cyr1
• 1.2.2.5 Pde1 和Pde2
• 1.2.2.6 Ras-cAMP 通路的其它成分
• 1.2.3 cAMP 依赖性蛋白激酶（cAPK）
• 1.2.3.1 cAPK
• 1.2.4 Ras-cAMP 通路的反馈抑制调节
• 1.2.5 葡萄糖诱导激活Ras-cAMP 通路
• 1.2.5.1 葡萄糖诱导激发cAMP 信号
• 1.2.5.2 葡萄糖信号分子的感受
• 1.3 本课题研究工作的任务
• 第二章 实验材料与实验方法
• 2.1 实验材料及仪器
• 2.1.1 主要实验仪器
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 酶制剂
• 2.1.4 菌株
• 2.1.5 培养基
• 2.1.6 溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.2 大肠杆菌的转化
• 2.2.3 质粒的提取（CTAB 法）
• 2.2.4 酵母染色体的快速分离
• 2.2.5 DNA 片段的回收纯化
• 2.2.6 酵母细胞的转化
• 2.2.7 PCR 反应体系
• 2.2.8 酶切体系
• 2.2.9 连接体系（20μl）
• 2.2.10 GFP 荧光定位观察方法
• 第三章 构建研究用质粒和菌株
• 3.1 构建研究用质粒
• 3.1.1 质粒V410 的构建
• 3.2 构建PDE1 基因缺陷型菌株
• 3.2.1 菌株YN100 和YN101 的构建
• 3.2.2 菌株YN123 的构建
• 第四章 Pde1 蛋白的亚细胞定位
• 4.1 概述
• 4.2 结果
• 4.2.1 葡萄糖对菌株YN123 的诱导效应
• 4.2.2 葡萄糖对菌株YN100 的诱导效应
• 4.2.3 葡萄糖对菌株YN101 的诱导效应
• 4.3 Pde1 在已出芽的酵母细胞中的分布
• 4.4 讨论
• 4.4.1 葡萄糖诱导下Pde1 的亚细胞定位
• 4.4.2 Pde1 在已出芽的酵母细胞中的分布
• 参考文献
• 附录
• 发表论文和参加科研的情况
• 致谢