论文摘要
目的通过对现有羊膜制备工艺进行研究比较,分别从灭菌、保存条件以及对传统羊膜贴载物改进这几个方面入手,以期寻找出一种对羊膜损伤小,便于制备,易于保存,更加方便临床使用且易推广的方法。本实验共分为三部分:实验一:检测常用灭菌方式对羊膜上皮性状影响实验二:探讨不同保存条件对羊膜性状的影响实验三:将无纺材料（聚丙烯无纺布,Polypropylene Non-woven Substrates）作为新型羊膜贴载物的研究方法实验一:取健康剖宫产产妇胎盘羊膜,随机分为四组,分别以抗菌素（含青霉素10,00U/ml,庆大霉素10,00U/ml、二性霉素B2.5μg/ml）、过氧乙酸/乙醇混合液（过氧乙酸12.5ml,96%乙醇125ml,蒸馏水362.5ml）、γ-射线、0.5%碘伏灭菌,行病原学检测确认达到临床运用标准后,HE染色观察羊膜上皮细胞形态变化;免疫荧光、RT-PCR检测肝细胞生长因子（HGF）、金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）及其mRNA的表达,并设未经任何灭菌处理的羊膜作为对照。实验二:将按常规方法制备好的羊膜随机分为三组,分别于4℃,-20℃以及-80℃保存1月,3月,6月后,分别行光镜以及电镜观察,比较不同保存组之间羊膜上皮细胞以及基质的变化,评估不同保存条件对羊膜的影响。实验三:用新型无纺布替代硝酸纤维滤膜作为羊膜贴载物,探讨羊膜与无纺布的不同贴载模式,并将羊膜分别贴载于硝酸纤维滤膜、无纺布后各置于纯甘油-80℃保存1个月,行HE染色、透射电镜检测,观察羊膜上皮细胞以及基质的形态。结果实验一:所采用的几种灭菌方法病原学培养结果均为阴性,经过氧乙酸/乙醇混合液和抗菌药处理的羊膜细胞形态完好,而经γ-射线处理的细胞形态损害较大。经灭菌处理后,羊膜细胞的HGF和TIMP-1蛋白表达均有所下降（P<0.05）,由高到低依次为PES组、抗菌药组、碘伏组和γ-射线组;HGF和TIMP-1的mRNA表达也有下降（P<0.05）,其中γ-射线处理组下降趋势更明显（P<0.05）,其余3个处理组间无明显差别（P>0.05）。实验二:经4℃保存的羊膜随着时间的延长羊膜上皮细胞破坏加重,在保存到3个月的时候,羊膜上皮细胞丢失较为严重。经-20℃和-80℃保存的羊膜上皮细胞随保存时间延长也出现破坏,但损害程度较小,且保存3个月与保存6个月相比较无明显差异。在相同时间点上,-20℃保存的羊膜与-80℃保存的羊膜相比较,上皮细胞有差异但不显著,远优于4℃保存。另外,羊膜基质在4℃保存6个月后发生变化,胶原纤维减少,而-20℃和-80℃保存的羊膜基质无明显变化。实验三:与传统的硝酸纤维滤膜相比较,无纺布作为羊膜贴载物更具优势:其拥有良好韧性,经折叠不易变型;保存时两者可紧密贴合不分开;临床使用时与羊膜易于辨别,在生理盐水中复水较短时间即可将其两者分开;形态学观察发现与传统的硝酸纤维滤膜相比较,无纺布对羊膜上皮细胞以及基质形态无明显影响。结论1、就现行常用的灭菌方式抗菌素浸泡、过氧乙酸/乙醇混合液浸泡、γ-射线照射、碘伏浸泡而言,过氧乙酸/乙醇混合液浸泡对羊膜的损伤最小,值得进一步研究。2、相对于其他保存温度而言,-20℃能较好的维持羊膜的形态,且该温度是现有普通家用冰箱都达到的条件,故该法可大范围推广,特别是适用于经济不发达地区的应用。3、无纺布作为羊膜贴载物比硝酸纤维膜更利于临床使用,简化了羊膜植片制作程序,且对羊膜形态无明显影响。将其作为羊膜载体是一种方便、有效、安全、可靠的途径。