黄瓜RubisCO活化酶基因（RCA）正义表达载体的构建及其遗传转化的研究

论文摘要

核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RubisCO）是光合碳循环中的关键酶,其活性高低是与光合暗反应能力密切相关。所以,具有稳定的RubisCO活性可能是植物适应逆境的主要途径。RubisCO只有处于活化状态时才具备催化功能,钝化态的RubisCO必须经过RubisCO活化酶（RCA）的活化才能表现出其羧化/加氧活性,即RubisCO在植物体内的活性受RCA的调节和控制。因此,RCA对调控植物的光合作用,增强其对逆境的适应能力具有重要作用。本研究从黄瓜叶片中克隆到RubisCO活化酶基因（RCA）,构建了其正义表达载体,用子房注射法导入黄瓜植株,同时研究了弱光、亚适温弱光和低温弱光下RubisCO大、小亚基及RubisCO活化酶基因的表达及其对光合作用的影响。主要结果如下:1.根据GenBank中印度黄瓜的RubisCO大、小亚基基因（rbcL、rbcS）序列设计特异引物,通过RT-PCR的方法从黄瓜叶片中克隆得到549 bp的大亚基和490 bp的小亚基基因片段,并在GenBank上注册（rbcL:EF208123,rbcS:EF208124）。2.根据GenBank中黄瓜的RCA序列设计特异引物,通过RT-PCR的方法从黄瓜叶片中扩增到基因全长cDNA。将其在GenBank注册,注册号为EFEF421974。3.将RCA基因的cDNA正向插入植物双元表达载体pCAMBIA1301的强启动子CaMV35S与终止子Tnos之间,成功构建RCA正义表达载体,命名为pCAMBIA1301-RCA。农杆菌介导法转化烟草,子房注射法转化黄瓜,获得了转正义基因的烟草和黄瓜植株。4.用实时荧光定量PCR法对弱光、亚适温弱光、低温弱光处理和对照（CK）黄瓜幼苗的rbcL、rbcS、RCA基因进行定量分析,结果表明,弱光和亚适温弱光处理的rbcL、rbcS和RCA相对表达量均明显降低,但57d后或趋于平稳,或缓慢回升;而低温弱光处理的rbcL、rbcS和RCA相对表达量呈直线下降,胁迫5d时rbcL和RCA的表达量接近零,rbcS较处理前降低63.9%。5.弱光、亚适温弱光和低温弱光处理的Pn变化趋势与rbcL、rbcS、RCA的相对表达量基本相似,表明弱光、亚适温弱光和低温弱光下rbcL、rbcS、RCA相对表达量降低是黄瓜幼苗光合速率降低的重要原因。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 RUBISCO 与植物的光合作用研究进展
• 1.1.1 RubisCO 的基本性质
• 1.1.2 结构与组装
• 1.1.3 活性调节及其活化机制
• 1.1.4 基因工程
• 1.2 RCA 与植物光合作用研究进展
• 1.2.1 RCA 的分子特性
• 1.2.2 RCA 对RubisCO 的活化
• 1.2.3 环境因子对RCA 的影响
• 1.2.4 RCA 基因工程
• 1.3 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 酶及生化试剂
• 2.1.4 PCR 引物
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 黄瓜rbcL、rbcS 片段和RCA 基因全长序列的获得
• 2.2.2 黄瓜RCA 基因正义表达载体的构建
• 2.2.3 根癌农杆菌LBA4404 感受态细胞的制备与转化
• 2.2.4 子房注射法转化黄瓜
• 2.2.5 低温弱光下rbcL、rbcS 和RCA 基因表达及其对光合速率的影响
• 3. 结果与分析
• 3.1 黄瓜RBCL、RBCS 及RCA 基因的克隆
• 3.1.1 rbcL 与rbcS 片段的克隆
• 3.1.2 RCA 基因的克隆
• 3.1.3 RCA 核苷酸及氨基酸序列
• 3.1.4 黄瓜RCA 基因的核苷酸与氨基酸序列同源性分析
• 3.2 黄瓜RCA 基因正义表达载体的构建
• 3.2.1 正义表达载体的构建
• 3.2.2 正义植物表达载体的鉴定
• 3.3 RCA 基因转化烟草
• 3.4 RCA 基因转化黄瓜及转基因植株的初步检测
• 3.5 低温弱光下黄瓜幼苗RBCL、RBCS 及RCA 基因的表达
• 3.5.1 目的基因与内参基因扩增效率一致性的检测
• 3.5.2 融解曲线分析
• 3.5.3 rbcL 和rbcS 基因表达
• 3.5.4 RCA 基因表达
• 3.5.5 低温弱光下黄瓜幼苗光合速率
• 4. 讨论
• 4.1 RNA 提取过程中的问题及对策
• 4.2 RCA 基因全长的获得
• 4.3 正义表达载体的构建
• 4.4 关于烟草组培过程中的问题
• 4.5 子房注射法获得转基因黄瓜
• 4.6 实时荧光定量测定光合关键酶的表达
• 5 结论
• 6 下一步研究工作的设想
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文