PCR技术检测测乳品中金黄色葡萄球菌研究

论文题目: PCR技术检测测乳品中金黄色葡萄球菌研究

论文类型: 硕士论文

论文专业: 微生物学

作者: 杨洋

导师: 张伟

关键词: 聚合酶链式反应,检测,乳品,金黄色葡萄球菌

文献来源: 河北农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 金黄色葡萄球菌是引起细菌性食物中毒的重要病源菌之一,国内外由金黄色葡萄球菌引发的食物中毒屡屡发生。引起食物中毒的食品多为动物性食品、乳及乳制品等。目前,国内检测食品中金黄色葡萄球菌仍采用传统的方法,其操作繁琐,检测时间较长,通常需要3～5d才能完成,且灵敏度较低。本研究针对食品中金黄色葡萄球菌PCR检测的特殊性,建立了快速检测乳品中金黄色葡萄球菌的PCR方法,消除PCR反应抑制因子,缩短食品中金黄色葡萄球菌的检测时间,提高检测方法的灵敏性,为金黄色葡萄球菌引起的食源性疾病的快速诊断提供技术支持。 本研究以金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因（nuc）为靶基因,选择特异性引物,进行PCR扩增,检测乳品中的金黄色匍萄球菌。对PCR反应体系中镁离子浓度、模板量及退火温度和循环数进行优化,以确定适宜PCR反应体系和PCR扩增程序,其适宜反应体系为:5μl 10XPCR buffer（200mM Tris-HCl[pH 8.3], 500mM KCl, 15mmMgCl2, 0.1%[wt/vol] gelatin, 0.5% Tween 20）, 4μl dNTPs混合物,0.5μl 40μmol正向引物,0.5μl 40μmol反向引物,0.25μl (5U·μl-1)Taq,模板2μl,水37.75μl,总反应体系50μl;其适宜PCR扩增程序为:PCR反应采用冷启动,94℃预变性4min,再按94℃1min～52℃0.5min～72℃1.5min进行35个循环,最后72℃延伸3.5min。PCR反应产物在2%的琼脂糖凝胶中进行电泳,凝胶成像系统观察结果。对PCR扩增产物进行了DNA测序,PCR扩增产物DNA序列与靶基因序列的同源性达99.6%,从而证实PCR扩增产物确为目的扩增产物。采用PCR方法共检测了60株金黄色葡萄球菌和20株其他革兰氏阳性菌和阴性菌,结果表明60株金黄色葡萄球菌中60株均为阳性结果;20株其它菌株均为阴性结果,因此本研究选择的引物特异性强。PCR方法的灵敏度为0.675pg。 本研究对乳品中金黄色葡萄球菌DNA的6种提取方法进行了比较,确定了一种可有效从乳品中提取金黄色葡萄球菌DNA的方法。该方法无需对样品进行增菌,可直接从乳品中提取金黄色葡萄球菌DNA,作为模板进行PCR检测,检测效果良好。采用该方法成功地从人工污染金黄色葡萄球菌的全脂乳、脱脂乳和奶酪中提取了金黄色葡萄球菌的DNA,消除了PCR反应抑制因子。这种直接从乳品中检测金黄色葡萄球菌的PCR方法灵敏度高,耗时短,全脂乳和脱脂乳检测的灵敏度为10cfu·ml-1,奶酪检测的灵敏度为55cfu·g-1,可在6h内完成对乳品中金黄色葡萄球菌的检测,比目前普遍采用的先增菌再进行PCR检测的方法缩短了12～24h。 本研究所采用的PCR检测乳品中金黄色葡萄球菌方法与国标GB 4789.10-94方法及两种快速检测致病性金黄色葡萄球菌测试片做了比较,结果表明: PCR方法的敏感性为100%,特异性为86.7%,符合率为94.3%,检测时间为6h;petrfilm RSA方法的敏感性为100%,特异性为93.3%,符合率为97.1%,检测时间为30h;Baird-Parker R. P. F方法的敏感性为100%,特异性为93.3%,符合率为97.1%,检测时间为30h。三种方法的敏感性相同,PCR方法的特异性低于其他两种方法,PCR方法的符合率稍低于其他两种方法,但PCR方法检测时间比其他两种方法缩短了24h。

论文目录:

1 引言

1.1 立题的背景和意义

1.2 金黄色葡萄球菌简介

1.2.1 金黄色葡萄球菌生物学特征

1.2.2 金黄色葡萄球菌的致病性

1.2.3 金黄色葡萄球菌的流行病学

1.2.4 金黄色葡萄球菌污染的控制

1.2.5 近年来由金黄色葡萄球菌导致的食物中毒事件

1.3 金黄色葡萄球菌检测方法研究现状

1.3.1 生物学方法

1.3.2 免疫学方法

1.3.3 基因探针技术

1.3.4 耐热核酸酶法

1.3.5 生物传感技术

1.3.6 超抗原技术

1.3.7 聚合酶链反应(polymerase chain reaction PCR)技术

1.4 研究内容

2 材料与方法

2.1 菌株

2.2 培养基

2.3 仪器与设备

2.4 样品与生化试剂

2.5 研究方法

2.5.1 PCR检测方法建立

2.5.2 PCR检测乳品中人工污染的金黄色葡萄球菌

2.5.3 乳品中金黄色葡萄球菌DNA提取方法比较：

2.5.4 PCR方法与其它快速检测金黄色葡萄球菌方法比较

3 结果与分析

3.1 PCR反应条件优化结果

3.2 PCR引物的特异性

3.3 PCR方法的灵敏度

3.4 PCR产物测序

3.5 PCR检测乳品中人工污染的金黄色葡萄球菌结果

3.6 乳品中金黄色葡萄球菌DNA提取方法比较结果

3.7 PCR方法与其它快速检测乳品中金黄色葡萄球菌方法比较结果

4 讨论

5 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢

发布时间: 2005-08-10

参考文献

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