家蝇蛹凝集素对B细胞免疫调节活性的研究

论文摘要

凝集素是一类具有糖结合专一性,可以促使细胞凝集的非酶非抗体蛋白质,由于糖的结合专一性可以发生多种生物学作用。家蝇生活在杂菌横生的环境中是多种疾病的传播者,而自身却不染病,这主要与家蝇的免疫防御作用密切相关。经过超滤浓缩、Sepharose4B亲和层析与DEAE离子交换法从家蝇蛹中分离纯化出分子量分别为38KDa,43KDa,56KDa和81KDa的四种凝集素,分别命名为MPL-1、MPL-2、MPL-3和MPL-4。凝血实验和B淋巴细胞的增殖活性实验说明MPL-3的凝血活性最高且对小鼠B淋巴细胞的增殖影响最为显著。利用高效液相色谱和SDS-PAGE对MPL-3的纯度进行检测,结果表明MPL-3是单一组分,希夫染色有红色蛋白条带出现,说明MPL-3含有糖链结构。苯酚-硫酸法测得其糖含量为2.72%,考马斯亮蓝（Bradfor法）测得蛋白含量为97.2%。MPL-3可以刺激小鼠B淋巴细胞,促进B细胞的增殖活性,且与MPL-3的剂量成依赖关系。MPL-3可以刺激B淋巴细胞促进IL-6、IL-12和IFN-γ的表达,且表达量与MPL-3的剂量成依赖关系。蛋白免疫印迹结果显示：MPL-3激活了ERK1/2和NF-κB信号通路,随着MPL-3浓度的增加ERK1/2的磷酸化水平,NF-KB的活化水平与IκBa蛋白的降解水平亦不断增强,ERK1/2抑制剂PD98059可以影响NF-κB的活化水平,而NF-κB的抑制剂PDTC却对ERK1/2的磷酸化水平没有影响,说明NF-κB作为ERK1/2的下游受ERK1/2的调控。抑制ERK1/2和NF-κB信号通路发现,小鼠B淋巴细胞的增殖活性和IL-6、IL-12、IFN-γ的表达水平均有所下降,说明小鼠B淋巴细胞的增殖和细胞因子IL-6、IL-12和IFN-γ的产生与ERK1/2-NF-κB信号通路相关。综上所述,MPL-3可以激活小鼠B淋巴细胞,并通过ERK1/2-NF-KB信号通路对其进行免疫调节,为开发天然免疫增强剂提供了一定的参考依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 家蝇的简介
• 1.2 凝集素
• 1.2.1 凝集素的简介
• 1.2.2 凝集素的分布和分类
• 1.2.3 凝集素的结构
• 1.2.4 凝集素的分离纯化
• 1.2.5 凝集素的生物学功能及应用
• 1.3 免疫
• 1.3.1 免疫的概述
• 1.3.2 免疫系统
• 1.3.3 细胞因子
• 1.4 MAPK信号通路
• 1.4.1 MAPK信号通路的概述
• 1.4.2 ERK1/2信号通路
• 1.5 NF-κB信号通路
• 1.5.1 NF-κB信号通路的简介
• 1.5.2 NF-κB的生物学作用
• 1.6 家蝇凝集素的研究进展
• 1.7 本课题研究的目的及意义
• 1.8 本课题研究的主要内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 动物材料
• 2.1.2 主要药品
• 2.1.3 仪器与设备
• 2.1.4 常用溶剂的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 家蝇的饲养
• 2.2.2 家蝇蛹凝集素的分离纯化
• 2.2.3 凝集素理化性质的检测
• 2.2.4 凝集素的功能检测
• 2.2.5 信号通路的研究
• 3 结果与讨论
• 3.1 家蝇凝集素的分离纯化
• 3.1.1 Sepharose 4B亲和层析分离纯化家蝇蛹凝集素
• 3.1.2 家蝇蛹凝集素组分和分子量的鉴定
• 3.1.3 DEAE离子交换分离纯化家蝇蛹凝集素
• 3.2 药物筛选
• 3.2.1 家蝇蛹凝集素的凝血活性
• 3.2.2 家蝇蛹凝集素对B细胞增殖的影响
• 3.3 MPL-3理化性质的检测
• 3.3.1 MPL-3的纯度和成分的鉴定
• 3.3.2 MPL-3的总糖含量
• 3.3.3 MPL-3的蛋白含量
• 3.4 MPL-3的功能检测
• 3.4.1 MPL-3的浓度对B细胞增殖作用的影响
• 3.4.2 MPL-3作用的时间对B细胞增殖作用的影响
• 3.4.3 MPL-3对B细胞细胞因子分泌的影响
• 3.5 MPL-3对B细胞的作用机理
• 3.5.1 MPL-3激活ERK1/2信号通路
• 3.5.2 MPL-3激活NF-κB信号通路
• 3.5.3 ERK1/2通路和NF-κB通路的关系
• 3.5.4 ERK1/2通路和NF-κB通路对B细胞增殖的影响
• 3.5.5 ERK1/2通路和NF-κB通路对B细胞分泌细胞因子的影响
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间论文发表情况
• 8 致谢