屎肠球菌TC3发酵工艺及对断奶仔猪应用效果研究

论文摘要

屎肠球菌TC3株由本实验室熊媛媛从健康仔猪肠道分离鉴定,具有良好的益生特性。本文主要对屎肠球菌TC3株的发酵工艺进行了优化,提高活菌数,为后期的工业生产做准备。将屎肠球菌TC3株发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液及枯草芽孢杆菌粉应用于断奶仔猪饲喂试验,研究微生态制剂对断奶仔猪生长性能及肠道菌群变化的影响。试验一屎肠球菌TC3发酵工艺优化本试验研究了TC3株在基础发酵培养基中的生长曲线,并通过单因子试验分别研究了接种量、装液量、10种碳源、9种氮源和5种缓冲体系对TC3株增殖的影响。结果表明TC3在基础培养基中12h达到稳定期；接种量对发酵终点活菌数的影响差异不显著；最佳装液量为60%；最佳碳源为蔗糖；最佳氮源为鱼粉；最佳缓冲体系为轻质CaCO3。Plackett-Burman试验研究了5个因子：蔗糖（X1）、酵母膏（X2）、鱼粉（X3）、MgSO4 （X4）、CaCO3 （X5）对TC3株增殖的影响。结果表明,主要的影响因子有三个,分别为蔗糖、酵母膏、CaCO3,其中正效应因子为蔗糖和酵母膏,负效应因子为CaCO3。通过最陡爬坡试验、Box-Behnken中心组合试验、响应面极值分析,确定最优配方为：蔗糖1.63%、酵母膏0.71%、轻质CaCO31.52%、鱼粉0.5%、MgSO40.01%。试验二益生菌发酵液用于断奶仔猪饲喂试验本试验利用两种益生菌发酵液、枯草芽孢杆菌粉与含抗生素（金霉素75 mg/kg）饲料和无抗生素饲料配合饲喂断奶（30日龄）仔猪（杜×长×大）30 d,分为四个处理：抗生素饲料组、屎肠球菌发酵液+抗生素饲料（屎肠组）、枯草芽孢杆菌发酵液+抗生素饲料（枯草组）、屎肠球菌发酵液+枯草芽孢杆菌粉+无抗生素饲料（益生菌组）,并采用PCR/DGGE技术分析试验期间各组肠道菌群变化。结果显示,屎肠组、枯草组、益生菌组的促生长性能较抗生素组不显著（P>0.5）,但腹泻率较抗生素组分别降低54.9%、41.4%和47.1%,腹泻指数分别降低55.1%和26.0%和51.9%。DGGE结果显示,仔猪在断奶后,试验前期,各组肠道菌群图谱较为复杂,没有明显的优势谱带,个体之间的相似性不大；试验后期,屎肠组和抗生素组在DGGE图谱上表现出一定的差异,屎肠组个体之间肠道菌群的相似性较抗生素组高,另外枯草组和益生菌组的图谱都显示出部分相同的优势菌群。由此可以推测,益生菌发酵液及枯草芽孢杆菌粉对断奶仔猪肠道菌群的发展和建立有一定影响。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1 益生菌概述
• 1.1 益生菌的定义
• 1.2 益生菌的筛选标准及菌种
• 1.3 益生菌的益生作用及机理
• 1.3.1 帮助宿主建立和维持正常的肠道优势种群
• 1.3.2 通过代谢产物和生理活性物质抑制或杀灭病原微生物
• 1.3.3 通过黏附机制和竞争排斥作用阻止病原菌的繁殖
• 1.3.4 加强黏膜屏障
• 1.3.5 增强免疫系统功能
• 1.3.6 提供营养物质促进生长
• 1.4 益生菌的生产工艺
• 1.4.1 固态发酵
• 1.4.2 液态深层发酵
• 1.4.3 液固两相发酵
• 1.4.4 合生发酵
• 1.4.5 浓缩工艺
• 1.4.6 干燥工艺
• 1.4.7 微胶囊技术
• 2 早期断奶仔猪的特点
• 2.1 消化道黏膜结构特点
• 2.2 营养消化特点
• 2.3 消化道微生物区系特点
• 2.4 免疫系统特点
• 2.5 内分泌系统特点
• 3 益生菌在断奶仔猪上的应用
• 3.1 提高生产性能
• 3.2 降低腹泻率,提高成活率
• 3.3 减少有害物质产生,改善畜舍环境
• 4 益生菌的研究方向
• 4.1 益生菌及其制剂的研发和应用
• 4.2 益生菌的作用机理
• 5 研究的目的意义
• 第二章 屎肠球菌TC3株发酵工艺优化
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试菌种
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 培养基配制
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 屎肠球菌发酵工艺优化
• 3 结果与分析
• 3.1 发酵培养基中的生长曲线
• 3.2 单因素发酵培养基及条件确定
• 3.2.1 接种量的影响
• 3.2.2 最佳装液量的确定
• 3.2.3 最佳碳源的确定
• 3.2.4 最佳氮源的确定
• 3.2.5 最佳缓冲体系的确定
• 3.3 Plackett-Burman（PB）设计
• 3.4 最陡爬坡试验
• 3.5 响应面法（RSM）
• 3.5.1 Box-Behnken设计及结果
• 3.5.2 响应面交互作用分析及优化
• 4 讨论
• 4.1 屎肠球菌的培养特性及发酵培养基组成
• 4.2 响应面法优化培养基
• 5 本章小结
• 第三章 益生菌发酵液对断奶仔猪应用试验
• 2 材料与方法
• 2.1 微生态制剂
• 2.2 所用试剂及配制
• 2.3 主要仪器设备
• 2.4 试验动物及试验设计
• 2.4.1 试验动物及分组
• 2.4.2 生产性能的测定
• 2.4.3 腹泻率及腹泻指数统计
• 2.4.4 死亡率统计
• 2.4.5 粪样样品的采集
• 2.5 DGGE凝胶电泳分析肠道菌群变化
• 2.5.1 粪样样品处理及细菌总DNA的提取
• 2.5.2 基因组DNA浓度、质量的测定
• 2.5.3 PCR扩增
• 2.5.4 变性梯度凝胶电泳（DGGE）
• 3 结果与分析
• 3.1 微生态制剂对断奶仔猪生长性能的影响
• 3.2 微生态制剂对断奶仔猪腹泻和死亡的影响
• 3.3 DGGE凝胶电泳分析结果
• 3.3.1 试验前期各组粪样基因组16S rRNA V3区PCR结果
• 3.3.2 试验后期各组粪样基因组16S rRNA V3区PCR结果
• 3.4 DGGE电泳图谱及多样性分析
• 3.4.1 试验期间各组DGGE电泳图谱多样性分析
• 3.4.2 试验期间各组DGGE电泳图谱相似性分析
• 4 讨论
• 4.1 试验方案
• 4.2 微生态制剂对生产性能和腹泻率的影响
• 4.3 益生菌对仔猪肠道菌群的影响
• 4.4 PCR/DGGE技术的应用
• 5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢