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油菜角果开裂相关基因的预测及其功能的初步鉴定

2020-12-02阅读(513)

油菜角果开裂相关基因的预测及其功能的初步鉴定

论文摘要

油菜角果开裂给油菜的生产带来了许多不利的影响,彻底弄清角果开裂过程及其潜在的遗传调节机制能为油菜抗裂角品种的培育及挑选提供新的途径。前期对模式植物拟南芥的研究,鉴定出几个转录调节因子通过调节裂区不同细胞形态的分化形成参与了拟南芥角果的开裂过程。这几个转录因子分别是:FRUITFULL（FUL）、SHATTERPROOF1（SHP1）、SHATTERPROOF2（SHP2）、INDEHISCENT（IND）、ALCATRAZ（ALC）。为了寻找油菜中以上几个基因的同源基因,本文运用BLAST手段在油菜cDNA库中搜寻到与这几个基因相似性比较高的一些EST序列和cDNA序列。通过拼接、克隆以及RACE方法,获得了几条与FUL、SHP1、SHP2、IND和ALC基因序列同源性比较高的cDNA序列,一个为已知基因BnSHP1,其它的暂命名为甘蓝型油菜的候选基因BnFUL-a、BnFUL-b、BnFUL-c、BnFUL-d、BnSHP2、BnIND和BnALC。RT-PCR结果显示,BnFUL-b、BnALC、BnSHP2和BnSHP1基因在花和角果中都有显著的表达,此外,BnFUL-b、BnALC、BnSHP2还在其它部位有表达。Southern杂交技术鉴定了BnSHP2基因在甘蓝型油菜基因组中至少存在两个拷贝。为了鉴定这几个预测基因的功能,本文构建了BnFUL-b基因的过量表达载体和BnALC基因的抑制表达载体,然后通过农杆菌介导转化甘蓝型油菜,通过PCR鉴定了转基因阳性植株。将BnALC、BnFUL-b、BnIND基因去除了终止密码的ORF片段构建到携带sGFP（S65T）荧光蛋白基因的瞬时表达载体上,通过基因枪轰击洋葱表皮细胞后,在荧光显微镜下观察洋葱表皮细胞发现细胞核内有强烈的荧光产生,表明这几个基因应该定位在细胞核内。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 绪论
  • 1.1 对油菜的生产需求
  • 1.2 角果开裂对油菜生产的影响
  • 1.3 角果开裂在模式植物——拟南芥中的研究
  • 1.3.1 拟南芥角果构造和角果开裂过程
  • 1.3.2 角果开裂的遗传学
  • 1.3.3 调控裂区细胞分化的基因
  • 1.3.4 参与角果开裂的下游效应物
  • 1.3.5 角果开裂的信号调节机制
  • 1.3.6 角果开裂的激素控制
  • 1.4 在油菜中的研究
  • 1.4.1 开裂机制及其调控的研究
  • 1.4.2 抗裂角油菜品种的选育
  • 1.5 本研究的目的和意义
  • 1.6 主要研究内容和技术路线
  • 1.6.1 主要研究内容
  • 1.6.2 技术路线
  • 第二章 油菜裂角相关基因的克隆及生物信息学分析
  • 2.1 材料
  • 2.1.1 植物材料、菌种、载体
  • 2.1.2 酶和化学试剂
  • 2.1.3 基本溶液的配制
  • 2.1.4 主要仪器设备
  • 2.1.5 引物设计与合成
  • 2.2 方法
  • 2.2.1 植物基因组DNA的小量提取
  • 2.2.2 植物总RNA的提取
  • 2.2.3 逆转录
  • 2.2.4 PCR
  • 2.2.5 连接反应
  • 2.2.6 大肠杆菌热击感受态的制备
  • 2.2.7 大肠杆菌感受态细胞的热击转化
  • 2.2.8 SDS-碱裂解法小量抽提质粒DNA
  • 2.2.9 BLAST与序列拼接
  • 2.2.10 RACE
  • 2.2.11 油菜裂角相关基因的分析
  • 2.3 结果与分析
  • 2.3.1 油菜IND,FUL,ALC,SHP1,SHP2基因序列的BLAST搜索与预测
  • 2.3.2 甘蓝型油菜中IND,FUL,ALC,SHP1,SHP2候选基因的克隆
  • 2.3.3 BnSHP2,BnALC基因的RACE
  • 2.3.4 油菜裂角相关基因ORF的获得和编码蛋白序列的推测以及结构域的预测
  • 2.3.5 油菜裂角相关转录因子的保守性分析及系统发育树的构建
  • 2.4 讨论与总结
  • 第三章 油菜裂角相关基因的转录水平及在基因组中的拷贝数
  • 3.1 材料和试剂
  • 3.1.1 材料
  • 3.1.2 酶和化学试剂
  • 3.1.3 试剂的配制
  • 3.1.4 一些必要的仪器
  • 3.2 实验方法
  • 3.2.1 油菜不同组织总RNA的提取及反转录PCR
  • 3.2.2 油菜裂角相关基因的RT-PCR扩增
  • 3.3 结果与分析
  • 3.4 讨论与总结
  • 第四章 油菜裂角相关基因功能的初步鉴定
  • 4.1 材料和试剂
  • 4.1.1 材料
  • 4.1.2 菌种、载体和试剂
  • 4.1.3 常用缓冲液
  • 4.1.4 培养基
  • 4.2 实验方法
  • 4.2.1 BnFUL-b基因和BnALC基因片断的克隆
  • 4.2.2 pCAMBIAl300-35S-FUL-b过量表达载体的构建
  • 4.2.3 pKANNIBAL-BnALC载体的构建
  • 4.2.4 pKANNIBAL-BnALC载体的Not Ⅰ酶切片断连接双元表达载体pART27
  • 4.2.5 农杆菌感受态细胞的制备
  • 4.2.6 冻融法转化农杆菌感受态细胞
  • 4.2.7 根癌农杆菌介导转化甘蓝型油菜
  • 4.2.8 转基因油菜的PCR鉴定
  • 4.3 结果与分析
  • 4.3.1 pCAMBIAl300-35S-BnFUL-b过量表达载体的构建
  • 4.3.2 pCAMBIAl300-35S-BnFUL-b过量表达载体转化农杆菌
  • 4.3.3 pCAMBIAl300-35S-BnFUL-b过量表达载体转基因植株的鉴定
  • 4.3.4 BnALC抑制表达载体（RNAi-BnALC）的构建
  • 4.3.5 BnALC抑制表达载体（RNAi-BnALC）转化农杆菌
  • 4.3.6 BnALC抑制表达载体（RNAi-BnALC）转基因植株的鉴定
  • 4.4 讨论与总结
  • 第五章 油菜裂角相关基因的亚细胞定位
  • 5.1 材料和试剂
  • 5.1.1 材料
  • 5.1.2 菌种、载体和试剂
  • 5.1.3 溶液配制
  • 5.1.4 主要仪器设备
  • 5.2 实验方法
  • 5.2.1 BnFUL-b、BnIND和BnALC基因核定位信号的预测
  • 5.2.2 BnFUL-b、BnIND和BnALC基因片断的克隆
  • 5.2.3 BnFUL-b、BnIND和BnALC基因定位载体的构建
  • 5.2.4 基因枪轰击洋葱表皮细胞
  • 5.2.5 荧光显微镜观察
  • 5.3 结果与分析
  • 5.3.1 BnFUL-b、BnIND和BnALC核定位信号的预测
  • 5.3.2 BnFUL-b、BnIND和BnALC定位载体的构建
  • 5.3.2 BnFUL-b、BnIND和BnALC在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位
  • 5.4 讨论与总结
  • 第六章 总结与展望
  • 6.1 主要工作总结
  • 6.2 工作展望
  • 参考文献（REFERENCES）
  • 致谢
  • 在学期间发表论文
  • 登录基因
  • 参加课题

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