基于RNA干扰的抗粗缩病转基因玉米材料创制

论文摘要

玉米粗缩病是一种在中国及世界玉米产区普遍发生的病毒性病害,对玉米生产危害极其严重。目前的农艺措施和化学药剂控制不能有效的防治玉米粗缩病,选育抗病品种才是最根本的途径。然而,当前的育种材料中,抗粗缩病种质资源有限,仅仅靠常规育种很难满足培育抗病品种的需求。本研究根据RNA干扰原理,将人工合成的玉米粗缩病毒干扰片段构建成RNA干扰载体,以玉米HiII幼胚为受体材料,利用农杆菌介导法将干扰基因转化到玉米基因组中,通过除草剂表型筛选、标记基因PCR检测、目的基因PCR检测、人工接种粗缩病毒抗病性鉴定,获得了抗粗缩病的转基因株系,以期望为抗粗缩病新品种的选育提供参考。主要研究结果如下:1.玉米粗缩病毒基因RNA干扰表达载体的构建在GenBank数据库搜索玉米粗缩病毒MRDV序列与水稻黑条矮缩病毒RBSDV序列并进行序列同源性比对,选取玉米粗缩病毒基因的一段大小为558bp的保守序列做为干扰序列并进行人工合成,经酶切连接转化,以正反向插入中间载体NPPLT,形成了含有内含子的反向重复序列结构,再经酶切连接转化,插入到具有Cre/loxP重组系统的表达载体PNCXB中,构建成玉米粗缩病毒基因RNA干扰表达载体PNCXB-848。2.农杆菌介导转基因体系的建立以玉米材料HiII大小为1.2-1.8mm的幼胚为受体材料,在OD600值为0.5,侵染时间为10分钟条件下,用农杆菌LBA4404侵染玉米幼胚,经共培养、静息培养、愈伤组织诱导、愈伤组织低压筛选（PPT浓度3mg/L）、高压筛选（PPT浓度6mg/L）,获得112株再生苗,建立了稳定的农杆菌介导玉米转化体系。3.再生植株除草剂表型筛选与PCR鉴定体系的建立为了确定再生植株除草剂（PPT）表型筛选的合适浓度,分别设立了30mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L不同浓度处理,五天后观察叶片表型,结果表明,200 mg/L除草剂（PPT）浓度为表型抗性筛选的最低易观察浓度。对T1代247株玉米进行除草剂表型筛选,92株表现为阳性,概率为37.2%。对T2代25个穗行进行除草剂表型筛选,11个穗行的除草剂抗性概率较高,均在40%以上,最高达100%。结合再生植株标记基因（Bar）、目的基因PCR检测,成功建立了转基因植株的鉴定体系。4.转基因穗行的抗病性鉴定以非转基因穗行W670、感病自交系Mo17、抗病自交系沈137作对照,对T2代的13个穗行,采取室内饲养灰飞虱、饲毒,在田间应用网箱集团接种灰飞虱技术进行粗缩病抗病性鉴定。感病对照Mo17发病概率为60%,非转基因穗行W670发病概率为57.1%,抗病对照沈137无明显发病症状。13个鉴定穗行中,3个穗行的发病概率相对较低,分别为15.8%、0%、0%,明显低于感病对照Mo17和非转基因穗行W670的发病概率,初步鉴定为转基因抗粗缩病株系,其它穗行全部或部分表现出明显粗缩病症状,建立了玉米粗缩病的鉴定体系。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 第一章 文献综述
• 1.1 玉米粗缩病的危害
• 1.2 玉米粗缩病的研究现状
• 1.2.1 玉米粗缩病的病原及病毒的形态结构
• 1.2.2 玉米粗缩病毒的寄主
• 1.2.3 玉米粗缩病毒的传播
• 1.2.4 玉米粗缩病的主要症状
• 1.2.5 玉米抗粗缩病种质资源鉴定
• 1.2.6 玉米粗缩病的抗性遗传研究
• 1.3 植物病毒病的抗病策略
• 1.3.1 利用病毒外壳蛋白介导的抗性
• 1.3.2 利用复制酶介导的抗性
• 1.3.3 利用运动蛋白介导的抗性
• 1.3.4 利用RNA 干扰介导的抗性
• 1.3.5 RNA 干扰在抗病毒基因工程中的优势
• 1.4 玉米遗传转化的研究进展
• 1.4.1 玉米遗传转化的受体材料
• 1.4.2 玉米遗传转化的选择标记
• 1.4.3 玉米遗传转化启动子的选择
• 1.4.4 玉米遗传转化方法的研究
• 引言
• 第二章 RNA 干扰抗粗缩病载体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 生化试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 试验方法
• 1.4.1 RNA 干扰目的基因的选择与克隆
• 1.4.2 标记基因Bar 的获得与改造
• 1.4.3 过渡表达载体PNCXB 的构建
• 1.4.4 loop 环和NOS 终止子的获得
• 1.4.5 CaMV35S 启动子的获得
• 1.4.6 正向目的片段插入
• 1.4.7 反向片段的插入
• 1.4.8 表达载体PNCXB-848 的构建
• 2 结果与分析
• 2.1 目的基因的选择与克隆
• 2.2 标记基因Bar 的获得与改造
• 2.3 过渡表达表达载体PNCXB 的构建
• 2.4 loop 环和NOS 终止子的获得
• 2.5 CaMV35S启动子的获得
• 2.6 正向目的片段的插入结果
• 2.7 反向目的片段的插入结果
• 2.8 表达载体PNCXB-848 的构建
• 3 讨论
• 3.1 RNA 干扰片段的选择与获得
• 3.2 RAN 干扰结构对沉默效率的影响
• 3.3 标记基因的选择
• 3.4 标记基因的删除
• 第三章 RNA 干扰基因的农杆菌介导转化
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 菌株
• 1.3 生化试剂
• 1.4 仪器
• 1.5 培养基和试剂的配制
• 2 试验方法
• 2.1 干扰基因的农杆菌电击转化
• 2.1.1 农杆菌感受态细胞的制备
• 2.1.2 重组质粒PNCXB-848 的电击转化
• 2.1.3 阳性菌株的 PCR 验证及保存
• 2.2 干扰基因的农杆菌介导转化
• 2.2.1 幼胚准备
• 2.2.2 农杆菌准备
• 2.2.3 农杆菌侵染幼胚
• 2.2.4 幼胚和农杆菌的共培养
• 2.2.5 静息培养
• 2.2.6 抗性愈伤组织的筛选
• 2.2.7 植株的再生
• 2.2.8 再生植株的环境适应
• 2.2.9 再生植株的管理
• 2.3 转基因植株T1 代的除草剂表型抗性筛选
• 2.3.1 除草剂喷洒浓度的确定
• 2.3.2 T1 代植株的除草剂筛选
• 2.4 T1 代植株植株的PCR 鉴定
• 2.4.1 DNA 的提取
• 2.4.2 标记基因的PCR 检测
• 2.4.3 目的基因的PCR 检测
• 2.5 转基因植株T2 代的除草剂筛选和PCR 鉴定
• 2.6 转基因植株T2 代的抗病性鉴定
• 2.6.1 田间试验设计
• 2.6.2 鉴定方法
• 2.6.3 玉米粗缩病的严重度分级
• 3 结果与分析
• 3.1 干扰基因的农杆菌电击转化结果
• 3.2 干扰基因的农杆菌介导转化结果
• 3.2.1 愈伤组织的诱导及抗性筛选结果
• 3.2.2 抗性愈伤组织的分化成苗
• 3.2.3 再生植株的大田生长结实
• 3.3 T1 代转基因植株的表型抗性筛选结果
• 3.3.1 除草剂喷洒浓度的确定
• 3.3.2 T1 代植株的除草剂表型抗性筛选结果
• 3.4 T1 代植株标记基因的PCR 检测结果
• 3.5 T1 代植株目的基因的PCR 检测结果
• 3.6 T2 代转基因植株的除草剂抗性筛选和PCR 鉴定结果
• 3.6.1 T2 代植株的除草剂抗性筛选结果
• 3.6.2 T2 代植株的PCR 鉴定结果
• 3.7 T2 代转基因穗行的抗病性鉴定结果
• 3.7.1 感病材料Mo17 和抗病材料沈137 的发病状况
• 3.7.2 T2 代转基因穗行的抗病性鉴定结果
• 4 讨论
• 4.1 农杆菌介导的影响因素分析
• 4.2 转基因植株的除草剂筛选浓度分析
• 4.3 转基因植株大田生长状况分析
• 4.4 转基因植株阳性概率分析
• 4.5 转基因植株的抗病性分析
• 参考文献
• ABSTRACT