降钙素基因相关肽在创伤性脑损伤加速骨折愈合中的作用机制研究

论文摘要

背景:创伤性脑损伤（traumatic brain injury,TBI）的患者如果合并有骨折,其愈合速度往往快于单纯骨折,这一加速现象在临床上十分常见,但机制至今未明。前人的研究多只限于单纯的骨折局部、骨细胞层面,或者是只针对少数因子的单一研究,很少有学者将受损脑组织、血循环、骨折局部三个系统与单一神经因子有序的联系起来。降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide,CGRP）作为广泛分布于骨骺、骨膜等骨组织中的神经肽,在脑损伤后,颅脑内的分泌明显增加,最近研究还发现CGRP具有较强的促进成骨能力。本课题组认为TBI与骨折愈合加快具有相关性,而CGRP可能在TBI加速骨折愈合中起着关键的作用,本课题得到了国家自然科学基金的资助（30872634）。我们前期的研究建立了标准的股骨中段闭合骨折模型（F组）和重复性好的脑损伤模型（TBI组）,首次应用显微CT的骨分析方法对比TBI+F组和F组的骨矿物质含量（BMC）和骨矿物质密度（BMD）,证实了SD大鼠在骨折合并脑外伤的情况下（TBI+F组）骨折愈合速度快于单纯骨折（F组）。为进一步探索TBI可以加速骨折愈合这一现象,前期研究又通过组织学观察比较受损脑组织和骨折局部肌肉组织中CGRP的表达变化,结果显示TBI+F组大鼠脑的脉络丛有明显的CGRP阳性染色,而F组大鼠脑脉络丛则没有出现这种阳性染色;TBI+F组骨折局部肌肉组织中CGRP的含量较F组升高,由此我们验证了TBI后血清中升高的CGRP与骨折愈合的加速具有正相关性。为进一步验证此相关性并阐明其作用机制,本课题组深入研究脑脊液中CGRP含量和骨折端CGRP受体表达的变化,并通过添加外源性的CGRP来观察其对骨髓间充质干细胞及破骨细胞的影响,深入探索CGRP在TBI加速骨折愈合中的作用机制。实验一降钙素基因相关肽及其受体在脑损伤合并骨折愈合中的表达变化目的:通过建立标准的同一个体的股骨闭合骨折模型及创伤性脑损伤模型,检测血清和脑脊液中CGRP含量的改变,以及骨折端CGRP受体表达的变化。方法:制作Sprague-Dawley大鼠标准股骨中段闭合骨折模型,其中部分大鼠接受TBI,在术后,一周内按照预设时间点连续处死大鼠取材股骨骨折端及抽取血清、脑脊液。取材不通时间点血清、脑脊液、及骨折端骨组织分别行ELISA、qRT-PCR检测CGRP及其受体水平变化。结果: ELISA检测表明TBI合并骨折组血清中CGRP明显升高（P<0.05）、脑脊液中CGRP明显升高（P<0.05）;qRT-PCR检测表明TBI合并骨折组的骨折端骨组织中CGRP受体表达量显著升高（P<0.05）。结论:上述结果证明TBI后骨折愈合加强。我们的实验结果进一步表明这种愈合加速的机制和受损伤脑组织释放入血的高水平CGRP有关。实验二外源性降钙素基因相关肽对SD大鼠骨髓间充质干细胞及破骨细胞的影响研究目的观察外源性CGRP对SD大鼠骨髓来源间充质干细胞（BMSCs）增殖和成骨分化功能以及破骨细胞增殖的影响,以进一步证明CGRP在脑损伤合并骨折愈合中起到关键的作用。方法采用贴壁法分离骨髓间充质干细胞,扩增传代至第三代,根据分组,培养体系中添加含不同浓度(10-1110-6mol/L)CGRP的条件培养液,WST-1法检测细胞增殖能力;碱性磷酸酶染色、定量检测及钙结节染色法观察CGRP诱导BMSCs向成骨细胞分化、矿化的效果。培养破骨细胞,在培养基中添加CGRP,经过TRAP染色,与普通培养基组的破骨细胞的生长增殖情况作对比。结果BMSCs增殖率测定以及碱性磷酸酶定量测定结果显示不同浓度的CGRP实验组均较空白对照组增加,且与所加的CGRP浓度呈剂量依赖关系,CGRP浓度大于1×10-10mol/L时差异有显著性（P<0.05）;碱性磷酸酶染色与钙结节染色结果显示,CGRP组均有阳性显色,对照组无显色或显色不明显。结论CGRP能够直接促进体外培养的BMSCs增殖,并可短期内诱导其向成骨细胞分化,而且能有效抑制破骨细胞的生成。CGRP可在骨修复及骨重建中发挥重要的作用。实验三外源性降钙素基因相关肽促进SD大鼠骨髓间充质干细胞分化的作用机制研究目的:观察外源性CGRP对体外培养的SD大鼠BMSCs成骨分化过程中细胞因子表达的影响,以探讨CGRP促进其成骨的作用机制。方法:采用qRT-PCR方法检测BMP-2、RunX2、碱性磷酸酶（ALP）、Ⅰ型胶原（COLL-Ⅰ）、骨粘连蛋白（Osteonectin,ON）等成骨相关细胞因子mRNA的表达。结果:CGRP组的细胞因子表达较空白对照组显著升高（p<0.05）。结论:CGRP能够通过BMP-2/Runx2通路促进BMSCs向成骨细胞分化。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 文献回顾
• 1.CGRP及其受体
• 2 CGRP与骨折愈合
• 3 CGRP与 TBI
• 4 展望
• 实验一 降钙素基因相关肽在脑损伤合并骨折愈合中的作用研究
• 1 材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 骨折模型的制作
• 2.2 脑外伤模型的制作
• 2.3 血清CGRP 含量ELISA 测定
• 2.4 脑脊液CGRP 含量ELISA 测定
• 2.5 实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）
• 2.6 统计学处理
• 3 结果
• 3.1 一般观察
• 3.2 血清 ELISA 检测结果
• 3.3 脑脊液 ELISA 检测结果
• 3.4 qRT-PCR 检测结果
• 4 讨论
• 实验二 外源性降钙素基因相关肽对SD大鼠骨髓间充质干细胞及破骨细胞的影响研究
• 1 材料
• 1.1 主要实验试剂
• 1.2 实验动物
• 1.3 主要仪器及设备
• 2 方法
• 2.1 SD 大鼠BMSCs 原代培养
• 2.2 SD 大鼠破骨细胞的培养
• 2.3 药物和分组
• 2.4 HE 染色
• 2.5 四唑盐（WST-1）比色分析法
• 2.6 碱性磷酸酶染色
• 2.7 细胞碱性磷酸酶（ALP）活性检测
• 2.8 茜素红染色
• 2.9 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色
• 2.10 统计学处理
• 3 结果
• 3.1 SD 大鼠BMSCs 形态学观察结果
• 3.2 SD 大鼠破骨细胞形态学观察
• 3.3 CGRP 对大鼠BMSCs 增殖率的影响
• 3.4 碱性磷酸酶染色情况
• 3.5 碱性磷酸酶定量测试情况
• 3.6 茜素红染色情况
• 3.7 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色观察
• 3.8 TRAP 阳性细胞计数
• 4 讨论
• 实验三 外源性降钙素基因相关肽促进SD大鼠骨髓间充质干细胞分化的机制研究
• 1 材料
• 1.1 主要实验试剂
• 1.2 实验动物
• 1.3 主要仪器及设备
• 2 方法
• 2.1 SD 大鼠BMSCs 原代及传代培养
• 2.2 药物和分组
• 2.3 骨细胞相关基因表达水平检测
• 2.4 统计学处理
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢