脱卵丘操作对家兔卵母细胞损伤的研究

论文摘要

脱去卵母细胞外的卵丘细胞后进行成熟培养是生发泡移植及研究卵丘细胞对卵母细胞作用等实验所必需的。对牛和小鼠等动物的研究说明,脱去卵丘的裸卵（DO）能够体外成熟和发育,尽管发育能力低于卵丘完好的卵丘-卵母细胞复合体（COC）。而且,与卵丘细胞共培养可部分恢复这些动物DO的成熟和发育能力。然而,我们在研究中却发现,家兔卵母细胞一旦脱掉卵丘则失去体外成熟能力。因此,我们怀疑脱卵丘的操作过程可能对兔卵母细胞造成了比其它动物更严重的不可逆损伤。在生发泡期,放射冠细胞和卵母细胞之间是通过连接子形成的缝隙连接进行物质交流。因此,通过机械的方法脱卵丘可能会对卵母细胞质膜产生影响。另外,已证明在用细玻璃管进行脱卵丘时可能会对卵母细胞产生一种剪切力,引起卵母细胞的凋亡。针对这些问题,本研究以家兔和小鼠卵母细胞为模型对比研究了脱卵丘操作对卵母细胞成熟和发育能力的影响。研究结果表明:1.庚醇阻断实验表明卵丘细胞影响兔卵母细胞的核成熟和卵裂,不影响随后的胚胎发育能力;但卵丘细胞不影响小鼠卵母细胞的核成熟,而影响卵母细胞孤雌激活后的胚胎发育能力。2.脱卵丘和共培养实验表明卵丘细胞对卵母细胞作用的发挥需要放射冠细胞和卵母细胞之间保持完整的缝隙连接。3.在缝隙连接被完全阻断即卵丘细胞的作用被完全去除时,大约50%的兔卵母细胞能成熟,而在完全脱去卵丘细胞后兔卵母细胞几乎不能成熟,说明脱卵丘操作严重损伤了兔卵母细胞,导致卵母细胞不成熟;但在缝隙连接被完全阻断时,小鼠卵母细胞的发育能力和DO差异不显著,表明脱卵丘操作没有影响小鼠卵母细胞。4. Hoechst33258染色实验表明,脱卵丘操作损伤了兔卵母细胞的质膜,这部分受损的卵母细胞在培养过程中退化;但脱卵丘操作却没有损伤小鼠卵母细胞的质膜,因此培养过程中小鼠卵母细胞不退化。5. Bcl-2抗体染色实验表明,脱卵丘操作会导致兔卵母细胞中Bcl-2的表达水平下降,引起卵母细胞的凋亡;脱卵丘后小鼠胞质中Bcl-2的表达水平与对照组COC差异不显著,所以这一操作过程没有影响小鼠卵母细胞的凋亡状态。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 哺乳动物卵母细胞的发育及成熟
• 1.2 卵丘细胞在卵母细胞成熟过程中的作用
• 1.3 有关缝隙连接
• 1.3.1 缝隙连接的结构
• 1.3.2 缝隙连接在卵泡发育中的作用
• 1.4 研究卵丘细胞对卵母细胞作用的方法
• 1.4.1 通过脱去卵丘研究卵丘细胞对卵母细胞的作用
• 1.4.2 通过缝隙连接阻断剂阻断卵丘对卵母细胞的作用
• 1.5 检测质膜完整性的方法
• 1.5.1 FAD 荧光染色
• 1.5.2 使用hoechst33258 检测质膜的完整性
• 1.5.3 台盼蓝染色
• 1.6 实验目的和主要研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 主要试剂的配制
• 2.2 实验动物及超排处理
• 2.3 卵母细胞的获取及体外成熟
• 2.4 体细胞和卵母细胞共培养
• 2.4.1 卵丘细胞单层的制备
• 2.4.2 卵丘细胞单层和卵母细胞（DO）共培养
• 2.5 分散的颗粒细胞和卵母细胞（DO）共培养
• 2.6 COC 和卵母细胞（DO）共培养
• 2.7 DOC 的制备和与卵丘细胞单层共培养
• 2.8 缝隙连接通透性的检测
• 2.8.1 显微操作针的制备
• 2.8.2 缝隙连接的阻断及LY 的注射
• 2.9 卵母细胞的孤雌激活及胚胎培养
• 2.10 质膜完整性的检测
• 2.11 Bcl-2 抗体染色
• 2.12 实验设计
• 2.13 数据统计分析
• 3 结果与分析
• 3.1 卵丘细胞对兔卵母细胞体外成熟和退化的影响
• 3.2 荧光黄检测不同浓度庚醇对兔COC 中缝隙连接通透性的影响
• 3.3 庚醇作用对兔卵母细胞体外成熟的影响
• 3.4 庚醇作用对兔卵母细胞发育的影响
• 3.5 卵丘细胞对小鼠卵母细胞成熟的影响
• 3.6 卵丘细胞对小鼠卵母细胞发育的影响及其发挥作用的 方式
• 3.7 荧光黄检测不同浓度庚醇对小鼠COC 中缝隙连接通透性的影响
• 3.8 庚醇作用对小鼠COC 和DO 成熟与发育的影响
• 3.9 小鼠DO 和兔DO 的Hoechst 33258 染色和培养后的退化情况
• 3.10 用Bcl-2 检测兔卵母细胞的凋亡情况
• 3.11 用Bcl-2 检测小鼠卵母细胞的凋亡情况
• 4 讨论
• 4.1 卵丘细胞对卵母细胞的作用
• 4.1.1 卵丘细胞和卵母细胞之间缝隙连接的作用
• 4.1.2 两种方法研究卵丘细胞对卵母细胞的作用
• 4.2 脱卵丘操作对卵母细胞的影响
• 4.2.1 脱卵丘操作对卵母细胞质膜的影响
• 4.2.2 脱卵丘操作对卵母细胞凋亡的影响
• 5 结论
• 参考文献
• 图版及图版说明
• 致谢