论文摘要
大量的研究表明许多环境中持续性存在的污染物可以模拟或干扰动物体内的内分泌功能,尤其干扰哺乳类、爬行类、鸟类和鱼类的生殖发育过程,这些天然或人工合成的化学物质称为环境内分泌干扰物（sendocrine disrupting chemicals,EDC）。有机氯农药滴滴涕（2,2-bis（4-chlorophenyl）-1,1,1-trichloroethane, DDT）和六六六（benzene- hexachloride, BHC）等是被确认的EDCs,由于其污染范围广、危害大、在环境中存留时间长并可通过食物链的生物放大作用而进入机体又被称为持久性有机污染物（persistent organic pollutants,POPs）,且主要以其代谢产物p,p’-DDE和β-BHC的形式存在。大量流行病学研究表明,DDT和BHC的异构体在多种环境介质和生物体内,以及人体脂肪、血液中均可被检出,特别是p,p’-DDE和β-BHC的检出率和残留水平均相当高。近年来,随着细胞信号转导途径研究的逐步深入,有机氯农药对信号转导途径特别是MAPK信号通路的作用引起了人们的广泛关注。Frigo等研究发现有机氯农药可引起应激介导的MAPK信号转导通路激活而导致AP-1的活化,从而调节细胞的增殖、分化及凋亡等。有报道指出,在哺乳动物睾丸中,丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protain kinase,MAPK）可调节细胞的增殖、分化及凋亡,被认为是精子发育的重要决定因素之一。本试验室前期的研究也证明了p,p’-DDE可诱导睾丸Sertoli细胞ERK MAPK信号通路的激活而对睾丸Sertoli细胞产生明显的影响。但p,p’-DDE和β-BHC单独及联合作用对睾丸Sertoli细胞MAPK信号转导通路c-jun氨基末端激酶（c-jun aminoterminal kinase, JNK）影响如何,尚未见报道。本研究的主要目的就是以Sertoli细胞（睾丸曲细精管中唯一的体细胞）作为靶细胞,以p,p’-DDE,β-BHC单独及联合作用为受试物探讨p,p’-DDE,β-BHC单独及联合作用对JNK MAPK信号转导通路的影响,从而探讨有机氯农药对雄性生殖系统的可能作用机制。第一部分: p,p’-DDE,β-BHC单独及联合作用对大鼠睾丸支持细胞活力的影响目的:探讨p,p’-DDE,β-BHC单独及联合作用对支持细胞活力的影响以确定对细胞的染毒剂量。方法:对离体培养的支持细胞分别以终浓度为10μmol/L、30μmol/L、50μmol/L、70μmol/L p,p’-DDE,β-BHC染毒24h后用MTT比色方法测其在490nm的吸光度值。在单独作用的基础上,将p,p’-DDE和β-BHC以1:1的比例配制成混合溶液,使两者的终浓度均分别为10、30、50μmol/L,用MTT比色方法测其在490nm的吸光度值。结果:不同浓度的p,p’-DDE,β-BHC及其两者联合染毒24h后,支持细胞的吸光度（OD值）随着染毒剂量的增加而逐渐降低。p,p’-DDE,β-BHC单独及联合作用50μmol/L剂量组与溶剂对照组相比均存在显著性差异（P<0.05）,其他浓度组与溶剂对照组没有显著性差异。50μmol/L剂量染毒组两者联合作用时支持细胞的吸光度最小,其次为p,p’-DDE染毒组和β-BHC染毒组,三者之间存在统计学差异（P<0.05）。结论:由此我们可以推断出50μmol/L是p,p’-DDE,β-BHC单独及联合作用于大鼠睾丸支持细胞出现明显毒性效应的最小作用剂量。p,p’-DDE对支持细胞的影响大于β-BHC,两者联合作用对支持细胞的影响大于两者单独作用,即两种农药共存时存在着一定的协同效应。第二部分:p,p’-DDE,β-BHC单独及联合作用对大鼠睾丸支持细胞JNK mRNA表达的影响目的:通过测定p,p’-DDE,β-BHC单独及联合作用于支持细胞后jnk mRNA的表达情况,探讨p,p’-DDE,β-BHC单独及联合作用对支持细胞JNK MAPK信号转导途径是否有影响。方法:用RT-PCR方法检测支持细胞JNK在mRNA水平上的表达情况。结果:①不同剂量p,p’-DDE,β-BHC单独及联合作用于睾丸Sertoli细胞24h后,Sertoli细胞jnk mRNA表达水平均随着染毒剂量的增加而逐渐升高,呈剂量依赖性。不同剂量染毒组（10,30,50μmol/L）与各自的DMSO对照组相比差异均存在显著性（P<0.05）。②p,p’-DDE、β-BHC单独作用之间比较,除DMSO对照组外,不同染毒组（10,30,50μmol/L）jnk mRNA表达水平p,p’-DDE组均显著高于β-BHC（P<0.05）;两者联合作用与单独作用相比,不同染毒组（10,30,50μmol/L）jnk mRNA表达水平联合染毒组显著高于单独染毒组（P<0.05）,而各DMSO两对照组之间mRNA表达水平无显著性差异（P>0.05）。结论:p,p’-DDE、β-BHC及二者联合作用于睾丸Sertoli细胞后,JNK基因转录水平均明显升高,且p,p’-DDE对支持细胞的影响大于β-BHC,联合作用比单独作用都更加明显,两者共存时存在一定的协同效应。第三部分:p,p’-DDE,β-BHC单独及联合作用对大鼠睾丸支持细胞p-JNK ,JNK蛋白表达的影响目的:探讨p,p’-DDE、β-BHC及二者联合作用对支持细胞的JNK MAPK信号转导途径是否有影响。方法:Western blotting方法来半定量p,p’-DDE,β-BHC及联合作用不同染毒剂量下p-JNK的表达情况以及在相同高浓度染毒后（50μmol/L）不同时间内的p-JNK的表达情况。结果:1.不同剂量p,p’-DDE,β-BHC及其联合作用于睾丸Sertoli细胞24h后,Sertoli细胞p-JNK1,p-JNK2蛋白表达水平均随着染毒剂量的增加而逐渐升高,呈剂量依赖性,不同染毒组（10,30,50μmol/L）与DMSO对照组相比差异均存在显著性（P<0.05）,而JNK1,JNK2蛋白表达水平却没有明显的变化,差异均无显著性（P>0.05）。p,p’-DDE、β-BHC单独作用相比,除DMSO对照组外,不同染毒剂量（10,30,50μmol/L）组p-JNK1,p-JNK2蛋白表达水平p,p’-DDE组均显著高于β-BHC（P<0.05）;两者联合作用与单独作用相比,不同染毒剂量（10,30,50μmol/L）p-JNK1,p-JNK2蛋白表达水平联合染毒组均显著高于单独染毒组（P<0.05）,各DMSO对照组之间蛋白表达水平均无显著性差异（p>0.05）。2.相同高剂量p,p’-DDE,β-BHC及其联合染毒后不同时间内大鼠Sertoli细胞p-JNK, JNK蛋白表达情况高剂量p,p’-DDE（50μmol/L）染毒后p-JNK1,p-JNK2蛋白表达水平先短暂激活后表达水平下降,然后出现第二次持续性的激活,12h和24h蛋白表达水平显著高于染毒前水平（P<0.05）,而JNK1, JNK2蛋白表达水平随着时间没有明显的变化,表达量之间没有显著性差异（P>0.05）。高剂量β-BHC（50μmol/L）染毒后p-JNK1,p-JNK2蛋白表达水平先短暂抑制,然后出现持续性激活,24h蛋白表达水平显著高于染毒前水平（P<0.05）,而JNK1, JNK2蛋白表达水平随着时间没有明显的变化,表达量之间没有显著性差异（P>0.05）。高剂量p,p’-DDE,β-BHC联合染毒后p-JNK1,p-JNK2蛋白表达水平先短暂激活后表达水平下降,然后出现第二次持续性的激活。24h蛋白表达水平显著高于染毒前水平（P<0.05）,而JNK1, JNK2蛋白表达水平随着时间没有明显的变化,表达量之间没有显著性差异（P>0.05）。结论:本研究表明p,p’-DDE,β-BHC及其联合作用均可引起睾丸Sertoli细胞JNK磷酸化水平增强,激活JNK通路,进而促进睾丸Sertoli细胞调亡而影响正常精子的发生,并且p,p’-DDE对支持细胞的影响大于β-BHC,p,p’-DDE与β-BHC两者共存时还具有一定的协同作用。第四部分:p,p’-DDE,β-BHC单独及联合作用对大鼠睾丸支持细胞c-jun mRNA表达的影响目的:通过测定p,p’-DDE,β-BHC单独及联合作用后支持细胞c-jun mRNA的表达情况,探讨p,p’-DDE,β-BHC单独及联合作用对支持细胞的JNK下游c-jun基因表达是否有影响。方法:用RT-PCR方法检测支持细胞c-jun在mRNA水平上的表达情况。结果:①p,p’-DDE,β-BHC及联合染毒各组随着染毒剂量的增大,Sertoli细胞c-jun mRNA表达水平均显著增加,且呈剂量依赖性关系（P<0.05）。②p,p’-DDE染毒组c-jun mRNA表达水平明显高于β-BHC染毒组（P<0.05）;联合染毒组c-jun mRNA表达水平比两者单独染毒时都更加明显（P<0.05）。结论:p,p’-DDE,β-BHC及二者联合作用于睾丸Sertoli细胞后,JNK下游c-jun基因转录水平明显升高,且p,p’-DDE单独作用强于β-BHC单独作用,两者联合作用比单独作用都更加明显。
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