论文摘要
背景钙网蛋白（Calreticulin, CRT）是内质网和肌浆网主要的钙结合蛋白之一。钙网蛋白有非常多的独特功能,包括维持细胞钙稳态、协助蛋白正确折叠、细胞凋亡等,并与心脏发育和多种心血管疾病的发生、发展和预后密切相关。已有研究发现钙网蛋白基因缺失（crt-/-）小鼠出现心脏发育不全,心室壁变薄,原因可能与细胞外基质含量变化有关,但机制未明;基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases, MMPs）是一组能降解细胞外基质与胶原的锌依赖蛋白酶。本课题组研究发现crt-/-小鼠胚胎成纤维细胞MMP-2表达较高,而MMP-9表达较低,但在野生型胚胎成纤维细胞（wt）中则完全相反,提示MMP-2和MMP-9的活性的改变可能是crt-/-小鼠心脏发育不全的机制之一,但MMP-2和MMP-9被激活为有活性的MMP-2和MMP-9的机制至今仍未完全阐明。前期的基因芯片结果提示Foxc2基因在两组细胞间存在明显的差异性表达,即Foxc2在wt细胞中具有含量高,而在crt-/-细胞中含量低,我们推测Foxc2可能参与了MMP-2/9的活性调节。Tsutomu Kume等研究发现,Foxc2在主动脉分支、流出道、心脏的间质和内皮细胞表达。Foxc2基因缺陷小鼠表现和钙网蛋白基因缺失小鼠都表现出心血管发育缺陷,鉴于Foxc2基因在两组细胞间存在明显的差异性表达,即Foxc2在wt细胞中具有含量高,而在crt-/-细胞中含量低,因此我们提出Foxc2可能参与了MMP-2/9的活性调节。本实验在以前原创性发现的基础上,探索核转录因子Foxc2是否参与到MMP-2/9活性调节的过程,从而更深一步探讨导致MMP-2/9改变的胞内作用机制,为阐明心脏形成、发育及相关病理过程提供新的理论依据,并为临床疾病的治疗提供新的方向。目的通过体外培养胚胎小鼠心肌成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblast cells, MEFs）野生株（wide type, wt）和钙网蛋白基因缺失株（calreticulin deficent, crt-/-）,探索核转录因子Foxc2与MMP-2和MMP-9活性调节关系,从而更深一步探讨探讨在钙网蛋白缺失型细胞中调节MMP-2和MMP-9活性变化的机制。方法体外培养wt和crt-/-两株细胞,利用基因芯片方法筛选两株细胞中基因表达差异较大的分子,选取Foxc2为研究对象。用RNA干扰（siRNA）的方法抑制wt细胞株的Foxc2表达,再用明胶酶谱分析重新检测胚胎成纤维细胞转染后MMP-2和MMP-9的活性变化。结果1.基因芯片分析结果:在wt细胞株与crt-/-细胞株中,核转录因子Foxc2的灰度比值大于3,取Foxc2为研究对象。2. RT-PCR检测wt及crt-/-株细胞中MMP-2和MMP-9的表达,发现在wt细胞株中,MMP-2低表达,MMP-9表达较高;相反,在crt-/-细胞株中,MMP-2表达高,而MMP-9表达低,两株细胞中的MMP-2和MMP-9表达差异具有统计学意义（P<0.05）。3.经过Foxc2转染后的wt株细胞,和阴性对照组（NC）比,RT-PCR结果提示Foxc2 mRNA的表达明显得到抑制,差异具有统计学意义（P<0.05）。4.经过Foxc2转染后的wt株细胞,明胶酶谱分析提示MMP-2的活性明显升高,MMP-9明显降低,表现出类似crt-/-株细胞MMP-2/9的改变,和空白对照组相比,差异具有统计学意义（P<0.05）;Foxc2转染后的MMP-2和阴性对照组相比,MMP-2升高得更明显,具有统计学差异（P<0.05）。5.经过转染处理的wt株细胞,MMP-9明显下降（P<0.05）,但在转染阴性对照及转染Foxc2之间,MMP-9无明显差异（P>0.05）。结论Foxc2参与了MMP-2和/或MMP-9活性的调节。
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