紫云英共生固氮基因AsIA257和AsIB259的功能研究

论文摘要

AsIA257是本实验前期通过抑制差减杂交技术,分离克隆的紫云英共生特异表达的二磷酸核苷磷酸酯酶（Diphosphonucleotide phosphatase, PPD）基因。核苷酸和氨基酸序列均与紫色酸性磷酸酶（Purple acid phosphatase, PAP）家族成员特别是来自黄羽扇豆的PPD1高度相似,推测其编码蛋白属于PAP中的PPD亚家族。本文通过构建AsIA257融合红色荧光蛋白和荧光定量PCR技术,研究了该基因的亚细胞定位和时空表达特征；进一步获得了AsIA257超表达植株,并检测了其结瘤表型。组织表达特征表明：AsIA257在接种后的根和根瘤中特异表达,且根瘤中·的表达量是根的5倍以上；在接种后27天表达量达到最高,随后又逐渐降低；同时在不固氮的无效根瘤中表达量显著增强。胁迫处理实验结果表明：氮胁迫,盐胁迫,黑暗处理时该基因表达量明显降低,但磷胁迫处理时,该基因大量表达,提示该基因可能与磷代谢有关。AsIA257融合红色荧光蛋白的洋葱表皮亚细胞定位结果显示：该蛋白定位于细胞膜上。紫云英根瘤的亚细胞定位结果显示：该基因定位于共生体膜上。以转化了空载体的根瘤为对照,Real-time-PCR检测结果表明：在接种后15天、27天和32天的根瘤中AsIA257均被超量表达,且超表达植株生长弱小,叶片发黄,结瘤数量显著减少为对照组的1/3。另外,本实验同时获得了AsIB259超表达转基因植株,实验结果显示其结瘤数量增加。以上结果初步揭示了共生特异表达的AsIA257和AsIB259基因在固氮过程中的调控功能,为深入研究其调控机制奠定了良好的工作基础

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 豆科植物-根瘤菌的共生固氮
• 1.2 豆科植物中共生固氮相关基因研究进展
• 1.2.1 结瘤信号传导相关基因研究进展
• 1.2.2 豆科植物中参与共生固氮的基因
• 1.3 紫色酸性磷酸酶（Purple acid phosphatase,PAP）
• 1.3.1 PAP家族
• 1.3.2 PPD亚家族
• 1.4 植物转脂蛋白LTP（Lid transfer protein）
• 1.5 植物共生固氮基因的研究方法
• 1.5.1 RNA沉默技术
• 1.5.2 基因表达定位
• 1.6 紫云英共生固氮相关基因研究进展
• 1.6.1 紫云英转化方法
• 1.6.2 紫云英相关基因研究进展
• 1.7 研究目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 植物及微生物材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 微生物材料
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 常用试剂及缓冲液
• 2.1.5 引物
• 2.1.6 植物转化及分子生物学相关试剂
• 2.1.7 主要耗材
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 分子生物学基本操作
• 2.2.2 紫云英总RNA的提取及纯化
• 2.2.3 目标基因在紫云英中的表达检测
• 2.2.4 胁迫处理实验方法
• 2.2.5 洋葱表皮亚细胞定位
• 2.2.6 转化植株根瘤细胞中的亚细胞定位
• 2.2.7 转基因植物的GUS组织染色
• 2.2.8 紫云英毛根转化
• 2.2.9 发根的结瘤实验
• 3 结果与分析
• 3.1 AsIA257在共生固氮中的功能研究
• 3.1.1 AsIA257基因克隆
• 3.1.2 AsIA257蛋白结构特点及功能预测
• 3.1.3 AsIA257在紫云英共生体系中的表达特征
• 3.1.3.1 紫云英植株RNA样品的提取
• 3.1.3.2 实时荧光定量PCR标准曲线的制作
• 3.1.3.3 AsIA257的组织器官表达特性
• 3.1.3.4 AsIA257在根瘤发育和固氮过程中的表达特性
• 3.1.3.5 AsIA257胁迫处理后的表达情况
• 3.1.4 AsIA257蛋白的亚细胞定位
• 3.1.4.1 重组质粒pBRed的制备
• 3.1.4.2 AsIA257融合蛋白载体的构建
• 3.1.4.3 AsIA257蛋白在洋葱表皮细胞的定位
• 3.1.4.4 AsIA257蛋白在紫云英根瘤细胞的定位
• 3.1.5 AsIA257在根瘤发育和固氮过程中的功能研究
• 3.1.5.1 AsIA257超表达载体的构建
• 3.1.5.2 发根农杆菌K599转化复合型超表达植株的获得
• 3.1.5.2.1 AsIA257超表达效率的检测
• 3.1.5.2.2 AsIA257超表达发根结瘤数量减少
• 3.2 紫云英共生固氮转脂蛋白基因-AsIB259功能的初步研究
• 3.2.1 AsIB259基因的克隆和3’非编码区的扩增
• 3.2.1.1 AsIB259基因的克隆
• 3.2.1.2 AsIB259基因的3’非编码区扩增
• 3.2.2 AsIB259在根瘤发育和固氮过程中的功能研究
• 3.2.2.1 AsIB259超表达载体的构建
• 3.2.2.2 AsIB259超表达植株的获得
• 3.2.2.2.1 AsIB259超表达效率的检测
• 3.2.2.2.2 AsIB259超表达发根结瘤数量增加
• 4. 讨论
• 4.1 AsIA257可能通过调节根瘤细胞ADP的水平在固氮调控过程中发挥作用.
• 4.2 AsIA257可能在早期结瘤过程中发挥作用
• 4.3 LTP可能通过与脂肪酸衍生物结合调节共生固氮
• 参考文献
• 致谢