论文摘要
鸡传染性支气管炎（infectiousbronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（avianinfectious bronchitis virus,IBV）引发的一种鸡的传染性疾病。IBV主要侵害鸡的呼吸道、肠道、输卵管及肾脏,可引起相应组织的上皮细胞病变和损伤,而且更重要的是容易因此而引起细菌及其它病原的继发感染,引起更大的损失,是造成目前生产上最普遍而且危害最大的鸡呼吸道综合症的重要病因之一。由于IBV在鸡群中感染的广泛性和普遍性,以及IBVRNA聚合酶有着特殊的校对机制和间歇性的复制过程,使得IBV基因组极易发生碱基的缺失、插入、点突变及不同来源的病毒基因之间发生重组。这样的结果是IB病毒的血清型、基因型和致病性等生物学特性极易发生变异,造成IB临床表现复杂及血清型众多,而各血清型之间仅有部分或完全没有交叉保护作用,从而给本病的免疫防控带来很大的困难。虽然我们在实际生产中使用IB疫苗对鸡群进行多次免疫,但是该病在广西仍不断发生并对养禽场造成了不小的损失。为了全面了解IB在广西家禽中的感染和流行情况,探明IBV主要流行株的类型及其地域分布;从基因水平上寻找IBV的传播、流行和危害的分子机制;同时建立泛素介导的IBV DNA多价疫苗构建技术平台,为高效安全的新型疫苗的研发提供技术平台和理论依据,彻底解决目前因疫苗所用毒株血清型与本地的存在差异而造成免疫效果不佳的难题,开展了本课题的研究。主要研究内容及结果如下:1、1985年-2012年广西IBV分子流行病学研究本研究对课题组1985-2012年间从广西主要养殖地区分离到的60株IBV,应用RT-PCR方法扩增其纤突蛋白（S1）、膜蛋白（M）、核蛋白（N）和3’UTR基因并进行了序列的测定、分析和比较,同时还构建它们的系统进化树,分析了 60株广西IBV分离毒株之间及与参考毒株之间的关系。结果表明,与我国常用IBV疫苗毒株及国外IBV毒株相比,广西大部分IBV分离毒株在这些结构基因的核苷酸及推导氨基酸序列存在广泛的基因突变、缺失或插入现象,广西IBV分离株具有多个基因进化群而且与常用疫苗株亲缘关系较远,这可能是造成广西IBV分离毒株基因组发生变异以及常用疫苗效果不佳的主要原因之一。从S1、N和M基因的进化关系上分析的结果显示广西IBV基因的遗传变异正处在一个不断演化的过程当中,其特征是同一时间段内分离到的病毒之间的核苷酸有较高的同源性,不同地域毒株之间无差异或存在的差异性较小;3’UTR基因研究结果表明大部分毒株之间亲缘较近,少部分毒株与参考株相比较存在不同程度的基因缺失。从进化树的分群关系我们发现,GX-NN1和GX-NN2存在明显的野毒株与疫苗株重组现象、GX-NN09093则可能是由疫苗株H120通过点突变演化而来。同时,对57株分离病毒和3株参考毒株进行了血清分型研究的结果显示,广西存在有7种不同血清型而且大部分的分离毒株血清型与疫苗株血清型不同,不同时期流行的优势血清型也不同,这也可能是导致目前所用疫苗免疫不佳的另外一个原因。此外,课题还对基因分型与血清分型之间的关系进行了探讨。2、鸡IBV广西不同时期分离株GX-C和GX-NN09032的全基因组序列测定及其生物信息学分析根据前面研究的结果,本研究选取不同时期广西IBV代表分离毒株GX-C和GX-NN09032.进行全基因组序列的测定。以GenBank公布的IBV全基因组序列作为参考进行引物设计和合成。在序列5’端和3’端RACE中使用商品化试剂盒,得到了两个分离毒株序列的5’端和3’端全长序列。测序结果表明GX-C基因组全长为27 701 bp,GX-NN09032基因组全长为27684bp。通过对这两个毒株全基因组的基因注释及各部分的同源性分析、全基因组序列与参考毒株的系统发育树构建、各个结构蛋白基因系统发育树构建等生物信息学分析,结果表明GX-C和GX-NN09032全基因组在核苷酸序列水平上分别与H120和GX-YL5的亲缘关系最近;各结构蛋白基因系统发育分析结果显示,两个分离毒株与参考株之间存在着不同程度的基因重组现象;进一步的分析还发现,GX-NN09032在S和3’ UTR基因分别存在明显基因重组和缺失现象。3、泛素介导鸡IBV主要抗原基因免疫应答的研究本研究应用基因重组技术,以pVAX1为载体将鸡的泛素（ubiquitin,Ub）基因与广西主要流行毒株GX-YL5的S1、N基因通过引入一段编码（G4S）3多肽的碱基linker进行连接,然后分别插入其多克隆位点,构建四个重组质粒pVAX1-N、pVAX1-Ub-linker-N、pVAX1-Ub-linker-N-S1及pVAX1-N-S1。经RT-PCR及间接免疫荧光技术确定目的基因及其蛋白在Vero细胞中的转录及表达情况。在动物免疫保护试验中,利用酶联免疫吸附试验、qPCR及流式细胞技术对不同试验组鸡的各项免疫指标进行了检测,最后应用攻毒试验进一步确定其免疫保护效果。RT-PCR检测的结果表明,转染了构建的重组表达质粒的Vero细胞中均能扩增出特异的N基因片段,表明四个质粒在细胞内分别转录出了目的基因的mRNA;间接免疫荧光检测结果表明,转染了四个质粒的Vero细胞均显示出特异性的绿色荧光,表明构建的重组表达质粒的均能在Vero细胞中表达出目的蛋白而且具有免疫原性;动物免疫试验结果表明,构建的重组表达质粒和商品疫苗H120免疫组各个日龄的免疫指标都高于空质粒对照组,其中泛素介导的重组表达质粒免疫组的外周血液中CD4+和CD8+T淋巴细胞数量、抗IBV特异性抗体水平以及免疫器官中IL-12和IFN-γmRNA的表达量,均有显著提高（P<0.05）,而以pVAX1-Ub-linker-N-S1免疫组最为明显。攻毒试验的结果表明不同免疫组的免疫保护率存在差异,细胞免疫应答水平高的免疫组保护率较高。结论:本研究的结果表明广西地区的IBV基因正在进行不断的演化和变异,加之已有的IB血清分型的结果我们可确定广西IB疫苗候选株。不同时期分离毒株的全基因组测序及分析发现IB毒株的进化与该时期毒株流行因素有关。通过对泛素与IBV抗原基因融合表达质粒的构建及其免疫应答的研究,建立了泛素介导的IBVDNA多价疫苗构建技术平台,为高效安全的新型疫苗的研发提供技术平台和理论依据。
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