鸡白细胞介素2在毕赤酵母中的表达与生物活性分析

论文摘要

家禽传染性疾病是养禽业中最大的威胁,给养殖业造成严重经济损失,免疫预防则是控制疾病的重要战略。但是在实际生产中,并不是所有疾病均有疫苗可用,也不是所有疫苗均可对机体产生完全免疫保护。特别是一些灭活苗和基因工程苗由于抗原性低等原因,免疫效果往往并不理想,时常造成免疫失败。鸡白细胞介素-2（Chicken Interleukin-2, ChIL-2）在家禽养殖业中可作为免疫佐剂,提高鸡体抵抗病原的免疫力,自1982年被发现以来一直是细胞因子研究中的热点之一,可望与疫苗配合使用,成为一种重要的细胞免疫佐剂,提高机体抗感染力,增强灭活苗或基因工程疫苗免疫效果。本文利用毕赤酵母（Pichia Pastoris）表达重组ChIL-2并对其提高鸡免疫功能的生理活性作了研究。首先将ChIL-2克隆至毕赤酵母穿梭表达质粒pPIC9K构建重组质粒pPIC9K/ChIL-2,经Sal I线性化酶切,电穿孔将其整合到毕赤酵母GS115（His+Mut+）染色体上,利用MM、MD平板筛选His+Mut+型阳性克隆,再用高浓度G418-YPD平板筛选高拷贝转化子。共筛选到了5株阳性克隆,用菌落PCR做进一步的筛选,得到3株高拷贝菌株。筛选到的高拷贝菌株进行BMGY/BMMY摇瓶培养,诱导表达重组ChIL-2。经SDS-PAGE与Western blot分析,证实ChIL-2基因在重组GS115中成功表达出约16 kDa与14 kDa两条特异性条带,这与天然ChIL-2分子量大小一致,提示与天然蛋白一样,重组ChIL-2可能也为糖基化蛋白。将重组的酵母菌株进行发酵生产,其表达量较摇瓶培养提高了20倍左右,达到约100 mg/L,重组目标蛋白质量分数达总蛋白的50 %以上。由于目的蛋白与杂蛋白带大小相差甚大,通过膜过滤截留就得到了高纯度的目的蛋白,操作简单。本研究为工业化生产鸡白细胞介素-2奠定了基础。将纯化到的ChIL-2与疫苗一起联合免疫鸡群,研究其作为免疫增强剂对禽流感病毒（avian influenza virus, AIV）疫苗和新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）疫苗的免疫增强效果,用血凝抑制试验检测鸡体血清中的AI抗体和ND抗体水平。实验结果表明:ChIL-2与禽流感或新城疫疫苗同时使用对疫苗有良好的免疫增强作用,能有效提高鸡体抗体滴度,延长抗体滴度的时间,提高存活率。ChIL-2的使用剂量应该在8.35μg/鸡左右。在使用的过程中,ChIL-2没有发现任何毒副作用,证明是一种安全高效的免疫增强剂。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 鸡白细胞介素2（ChIL-2）研究概况
• 1.1.1 ChIL-2 研究进展
• 1.1.2 ChIL-2 的发现及纯化
• 1.1.3 ChIL-2 的分子克隆和结构
• 1.1.4 ChIL-2 活性检测
• 1.1.5 ChIL-2 的表达
• 1.1.6 ChIL-2 的应用
• 1.2 研究目的与意义
• 1.3 研究内容与技术路线
• 1.3.1 研究内容
• 1.3.2 技术路线
• 参考文献
• 第二章 ChIL-2 基因真核表达载体的构建和高抗性重组菌株的筛选及鉴定
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 溶液
• 2.1.4 实验仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 获取目的DNA 片段
• 2.2.2 pPIC9K 质粒的小量抽提
• 2.2.3 双酶切目的 DNA 片段及pPIC9K 质粒
• 2.2.4 连接
• 2.2.5 转化
• 2.2.6 重组质粒的抽提及鉴定
• 2.2.7 重组酵母的筛选及鉴定
• 2.3 结果
• 2.3.1 目的基因的扩增及重组载体的构建
• 2.3.2 酶切鉴定重组质粒pPIC9K/ChIL-2
• 2.3.3 电转化毕赤酵母
• 2.3.4 高拷贝重组菌株的筛选
• 2.4 讨论
• 2.4.1 ChIL-2 基因的克隆
• 2.4.2 外源蛋白在毕赤酵母中的表达机理
• 2.4.3 毕赤酵母的高效表达
• 参考文献
• 第三章 ChIL-2 在毕赤酵母中的表达、发酵及纯化
• 3.1 材料
• 3.1.1 试剂
• 3.1.2 实验溶液
• 3.2 仪器
• 3.3 方法
• 3.3.1 重组酵母菌株生长曲线的测定
• 3.3.2 重组酵母菌株的诱导表达
• 3.3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 3.3.4 表达上清的浓缩及Western blot 鉴定
• 3.3.5 ChIL-2 在毕赤酵母中的发酵与纯化
• 3.4 结果
• 3.4.1 重组毕赤酵母摇瓶培养的生长曲线
• 3.4.2 ChIL-2 的摇瓶表达及鉴定
• 3.4.3 ChIL-2 的发酵生产
• 3.4.4 ChIL-2 的纯化
• 3.5 讨论
• 3.5.1 重组表达ChIL-2 分子量大小的讨论
• 3.5.2 发酵生产
• 3.5.3 纯化
• 参考文献
• 第四章 表达蛋白的生物活性检测
• 4.1 材料
• 4.1.1 实验动物
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 实验溶液
• 4.2 仪器
• 4.3 方法
• 4.3.1 急性毒性实验研究
• 4.3.2 ChIL-2 对禽流感疫苗H5N1 亚型Re-1 株灭活苗的免疫增强效果研究
• 4.3.3 ChIL-2 对新城疫灭活苗的免疫增强效果研究
• 4.4 结果
• 4.4.1 对小鼠的安全性
• 4.4.2 ChIL-2 对禽流感疫苗H5N1 亚型Re-1 株灭活苗的免疫增强效果研究
• 4.4.3 ChIL-2 对新城疫灭活苗的免疫增强效果研究
• 4.5 讨论
• 4.5.1 血凝抑制试验
• 4.5.2 ChIL-2 的免疫增强效果
• 参考文献
• 第五章 结论与展望
• 致谢
• 在学期间发表的学术论文