论文摘要
研究背景炎性肠病（inflammatory bowel diseases,IBD）尤其是溃疡性结肠炎（ulcerativecolitis,UC）在我国的发病率呈逐年上升趋势,但其病因、发病机制目前仍不清楚。糖皮质激素、柳氮磺胺吡啶（salazosulfapyridine,SASP）是治疗IBD的常规药物,但此两类药物长期应用毒副作用大,且对部分病人无效,因此开发毒副作用小而有效的治疗IBD的药物具有重要意义。羧胺三唑（carboxyamidotriazole,CAI）是一种能够抑制细胞外钙内流的化合物,其在体外和体内模型中均表现出一定的抑制肿瘤增殖和转移的作用,此外该化合物还具有抑制血管生成、花生四烯酸释放以及激活NF-κB通路的作用。本课题组通过动物实验已证明该药物对急性、亚急性和慢性炎症具有显著的抗炎作用。为考察该药物对UC的潜在治疗作用,我们通过建立葡聚糖硫酸钠（dextran sulphate sodium salt,DSS）诱导的小鼠结肠炎模型,并施予CAI,观察其疗效,并从组织水平、细胞水平和分子水平探讨CAI对这种结肠炎模型的保护作用及作用机制,为进一步的临床研究奠定基础。研究方法采用DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎模型,观察小鼠的体重和粪便变化,用大便性状改变和有无便血这两项指标评价小鼠的症状。取静脉血并将小鼠处死,制作结肠标本,HE染色观察结肠组织学变化,进行粘膜损害程度评分,采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清、结肠匀浆和腹腔巨噬细胞培养上清中肿瘤坏死因子（tumornecrosis factor,TNF）-α、白介素（interleukin,IL）-1β、IL-6水平,采用ELISA法测定血清和结肠匀浆中基质金属蛋白酶-2,9（matrix metalloproteinase,MMP-2,9）和转化生长因子β1（transforming growth factor,TGFβ1）的含量。采用免疫组化方法观察小鼠结肠中细胞间粘附分子（intercellular adhesion molecule,ICAM）-1、核转录因子（nuclear factor,NF）-κB和TNF-α的表达或活化情况。检测小鼠结肠匀浆中髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）的活性。检测小鼠结肠匀浆中丙二醛（malonaldehyde,MDA）的含量和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）的活性。采用硝酸还原法测定小鼠结肠匀浆中一氧化氮（NO）的含量。采用Western Blot法测定小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、IκBα和磷酸化IκBα的表达情况。采用Masson’s染色法观察小鼠结肠组织中胶原沉淀的情况。研究结果1.3%DSS能够成功诱导小鼠溃疡性结肠炎模型,其肠道病理变化类似于人类溃疡性结肠炎的病理改变。溃疡性结肠炎小鼠肠粘膜充血、水肿、糜烂或溃疡形成,粘膜炎症细胞浸润（主要为中性粒细胞）及隐窝脓肿形成。2.CAI（20 mg/kg）对3%DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎具有保护作用。连续10天给予小鼠20 mg/kg的CAI后,小鼠的体重、粪便和血便情况均有不同程度的改善。大体见CAI治疗组动物结肠充血、肠壁增厚明显减轻,粘膜缺损区浅小;组织学观察见粘膜损害累及的结肠范围缩小,毛细血管扩张、淋巴滤泡增生、粘膜下层水肿和隐窝结构破坏程度明显减轻。系列浓度的CAI（5、10、20和30 mg/kg）对3%DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎具有剂量依赖性的保护作用。同时CAI（20 mg/kg）对2%DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎也具有治疗作用。3.与正常对照组相比,饮用DSS的小鼠血清、结肠匀浆和腹腔巨噬细胞培养上清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高,经CAI治疗后均降低。小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量分别降低了66.75%、20.19%和26.49%,小鼠结肠匀浆中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量分别降低了55.00%、74.95%和64.33%,小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量分别降低了80.41%、13.03%和58.58%。4.免疫组化的检测结果显示,溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中TNF-α、NF-κB p65和ICAM-1表达明显升高,经CAI治疗后,小鼠结肠组织中TNF-α、NF-κBp65和ICAM-1的表达明显下降。5.与正常对照组相比,饮用DSS的小鼠结肠匀浆中MPO的活性升高,给予实验动物CAI后,MPO的活性明显降低,下降了13.58%。6.给予实验动物CAI后,溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中MDA的含量显著降低,而SOD的活性则显著升高。与PEG400组相比,MDA的含量降低19.57%,SOD的活性升高29.14%。7.饮用DSS的小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中NO水平升高,但经CAI治疗后显著降低,小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中NO含量降低了24.53%。经CAI治疗后,小鼠腹腔巨噬细胞中iNOS的表达量下降。8.CAI能够显著抑制DSS引起的小鼠腹腔巨噬细胞中IκBα的降解以及磷酸化IκBα含量的升高。9.与正常对照组相比,饮用DSS的小鼠血清和结肠匀浆中MMP-2和MMP-9的含量升高,但经CAI治疗后,血清和结肠匀浆中MMP-2的含量分别下降了27.75%和47.14%;然而MMP-9的含量却未发生明显改变。10.溃疡性结肠炎小鼠经CAI治疗后,结肠匀浆中TGF-β1含量下降了52.43%。Masson’s三色染色的结果显示,CAI能够显著降低小鼠结肠组织中胶原纤维的沉积。结论CAI对DSS诱导的小鼠实验性结肠炎具有预防和治疗作用,且上述作用呈现出剂量依赖关系。CAI可显著改善结肠炎小鼠的腹泻和便血,减轻肠道充血和水肿及粘膜损害的范围和程度。CAI能够抑制NF-κB的活化,并通过清除粘膜活性氧,抑制TNF-α、IL-1β和NF-κB的激活,阻断相互激活的正反馈通路,阻断IL-6、IL-1β和ICAM-1的产生,最终表现为TNF-α、IL-1β、IL-6和ICAM-1低水平表达,从而减轻肠道炎性损害,改善结肠炎症状。CAI能够降低模型小鼠结肠中TGF-β1的含量,进而减少病变结肠中胶原纤维的含量,最终起到延缓病变结肠纤维化的作用。综上所述,根据我们的研究结果可以推测,CAI作为一种口服有效且副作用较少的药物,对溃疡性结肠炎的临床治疗具有较高的潜在应用价值。
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