论文摘要
研究背景与目的：足细胞即肾小球脏层上皮细胞,位于肾小球基底膜的外侧,对维持肾小球滤过功能起重要作用,还能合成生理及病理状态下细胞外基质,表达多种细胞因子及其受体,同时足细胞也受到肾小球鲍曼囊多种化学信号的刺激。当肾脏受到各种致病因素时,足细胞是肾小球最易受到损伤的细胞成分。血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是肾素-血管紧张素系统（RAS）的主要效应分子,也是导致肾脏病进展和足细胞损伤的重要原因之一。本课题组前期体内及体外研究均发现AngⅡ可诱导足细胞凋亡,但AngⅡ诱导足细胞凋亡的具体分子机制尚未完全阐明。近年来研究发现非受体蛋白酪氨酸激酶c-Abl在上皮细胞以及神经元的凋亡过程中发挥着重要作用,且c-Abl在不同种属的多种组织及细胞中表达,但无c-Abl在足细胞表达的报道。本研究拟采用体内动物实验及体外培养永生化细胞株观察足细胞是否有c-Abl表达,以及观察c-Abl与促凋亡蛋白p53的相互作用,来探讨c-Abl在AngⅡ诱导足细胞凋亡中的分子机制。方法：第一部分：用AngⅡ （400ng-kg-1min-1）泵植入Wistar大鼠皮下建立AngⅡ输注模型,将24只成模大鼠随机分为AngⅡ输注2周组（B组）、AngⅡ输注4周组（E组）、AngⅡ输注+ARB（替米沙坦,5Omg·kg-1d-1）干预2周及4周组（C、F组）,同时设生理盐水输注2周及4周组（A、D组）,每组大鼠6只。实验2周末、4周末留取大鼠24小时尿液检查尿总蛋白定量,并处死大鼠取肾,电镜观察大鼠肾脏超微结构,TUNEL法检测肾脏石蜡切片足细胞的凋亡,用免疫组化、Realtime-PCR及Western印迹法检测肾脏c-Abl表达分布及c-Ab1mRNA、蛋白的表达。第二部分：体外培养条件永生化小鼠足细胞,未分化足细胞用33℃培养基培养2周后转至37℃孵箱7-14天,细胞药物干预前用无血清培养基同步化12h。（1）免疫荧光观察生理状态下足细胞c-Ab1的分布。（2）加入不同浓度AngⅡ （10-99M～10-6M）作用于足细胞不同时间（0h、3h、6h、12h、24h）,应用Realtime-PCR、 Western blot方法检测足细胞c-Abl mRNA及蛋白表达水平的变化。（3）使用c-Abl激酶抑制剂Src-Il,观察其对AngⅡ诱导足细胞凋亡的影响。（4）转染c-Abl siRNA,探讨其对AngⅡ诱导足细胞凋亡的影响。（5）转染c-Abl质粒,观察其对AngⅡ诱导足细胞凋亡的影响。第三部分：体外培养条件永生化小鼠足细胞,未分化足细胞用33℃培养基培养2周后转至37℃孵箱7-14天,细胞药物干预前用无血清培养基同步化12h。（1）观察Ang Ⅱ以及c-Abl抑制剂Src-I1对足细胞磷酸化c-Abl Y412、Y245的表达改变。（2）胞浆胞核蛋白分离,观察AngⅡ诱导足细胞胞浆、胞核c-Ab1表达改变,以及免疫荧光观察胞浆胞核c-Ab1蛋白的表达改变。（3）用Western印迹法检测c-Ab1抑制剂Src-I1对AngⅡ诱导足细胞胞核p53蛋白的改变,用免疫共沉淀观察足细胞c-Abl与p53在细胞核内聚集变化。结果第一部分：（1） AngⅡ输注2周后大鼠出现明显蛋白尿（P<0.05）,4周后尿蛋白定量进一步增加（P<0.05）,而ARB干预组尿蛋白定量较同期AngⅡ输注组明显减轻（P<0.05）。（2）TUNEL法检测提示AngⅡ输注2周组即出现足细胞凋亡,AngⅡ输注4周组足细胞凋亡进一步增加。（3）电镜观察发现AngⅡ输注2周组大鼠出现足突融合,4周组足突明显融合,基底膜增厚,部分球囊粘连,ARB干预组病变较同期AngⅡ输注组明显减轻。（4）免疫组化、Realtime-PCR及Western blot均提示各组大鼠肾脏表达c-Abl,主要分布于肾小球足细胞和肾小管上皮细胞的胞浆和胞核,且AngⅡ输注2周组大鼠肾脏及足细胞c-Abl表达较生理盐水输注组明显增加（P<0.05）,AngⅡ输注4周组肾脏及足细胞c-Ab1表达增加更明显（P<0.05）；ARB干预2周、4周组大鼠肾脏及足细胞c-Ab1表达较同期AngⅡ输注组均有降低（P<0.05）。第二部分：（1）免疫荧光显示生理条件下,c-Abl在体外培养的条件永生化小鼠足细胞的胞浆及胞核中表达,主要在胞浆中表达。（2） AngⅡ诱导培养的小鼠足细胞c-Abl mRNA和蛋白水平表达增加,呈时间和剂量依赖性。（3）c-Abl激酶抑制剂Src-I1可以减轻AngⅡ诱导的足细胞凋亡。（4）c-Abl siRNA可以减轻AngⅡ诱导的足细胞凋亡。（5）c-Abl质粒转染可以加重AngⅡ诱导的足细胞凋亡。第三部分：（1）AngⅡ诱导足细胞磷酸化c-Abl Y412、Y245蛋白表达增加。（2）胞浆胞核蛋白分离后,Western印迹显示AngⅡ诱导足细胞胞核c-Abl蛋白表达增加,胞浆c-Abl蛋白表达无明显改变,免疫荧光观察亦发现c-Abl在足细胞胞核表达增加。c-Abl激酶抑制剂Src-Il减轻AngⅡ诱导的足细胞胞核c-Abl表达增加。（3） Western印迹显示AngⅡ诱导培养的小鼠足细胞胞核p53蛋白表达增加,且呈时间依赖性,c-Ab1激酶抑制剂Src-I1可以减轻AngⅡ诱导的足细胞胞核p53增加。AngⅡ诱导培养的小鼠足细胞胞c-Ab1与p53两者共沉淀增加。结论：（1）大鼠肾脏足细胞、体外培养的小鼠足细胞表达c-AbL。（2） AngⅡ诱导足细胞胞核c-Abl表达增加及足细胞凋亡,抑制c-Abl表达可减轻Ang1Ⅱ诱导的足细胞凋亡,上调c-Abl表达可增加AngⅡ诱导的足细胞凋亡。（3） c-Abl主要通过p53介导AngⅡ诱导的足细胞凋亡。