胸膜肺炎放线杆菌STM突变体库的构建及tadD基因功能的初步研究

论文摘要

胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）是猪传染性胸膜肺炎的病原菌,给全球养猪业造成巨大的经济损失。预防和控制该病的主要措施是疫苗免疫接种。但由于APP血清型众多,而且各血清型之间交叉保护力较低,给应用传统疫苗对该病进行免疫预防带来了极大的困难。人们采取了各种灭活疫苗、亚单位疫苗的免疫措施和方法来控制和预防该病,但效果均不是十分理想。因此,迫切需要更安全、高效的新型疫苗来预防和控制该传染病的发生与流行。而毒力因子的全面鉴定与功能研究是病原菌致病机理解析和防治产品开发的基础,为此,本论文开展了如下两方面的研究工作:（1） STM转座突变体的构建:信号标签突变（signature-tagged mutagenesis,STM）技术是由Holden等人于1995年建立的一种鉴定病原菌毒力基因的高通量方法。它是以整个基因组为基础的研究病原体致病机制,可在体内对毒力基因进行高通量筛选的一种新方法。本研究用STM技术构建APP的突变体库,用于该菌感染及毒力相关基因的发掘与功能研究。本文用含有Tn10转座标签质粒pLOF/Tag1-48的E.coli S17-1λpir转化子与APP-1型菌株S4074进行接合杂交,目前获得了其中4个标签（Tag3,Tag4,Tag13,Tag14）的211个APP血清1型突变体,为胸膜肺炎放线杆菌STM突变体库构建和功能基因的发掘奠定了基础。（2） tadD基因的结构与功能研究:flp操纵子广泛存在于细菌和古细菌中。flp操纵子在不同的细菌中有不同的功能,主要与细菌菌落形成,细菌菌毛合成,细菌黏附于宿主特定细胞等功能有关。tadD基因是flp操纵子上的重要基因,但是人们对APP中tadD基因的功能还不清楚。本研究从APP-1型菌株S4074中扩增了tadD基因的上下游片段,将得到的上下游片段,连接到携带蔗糖敏感基因（SacB）的自杀性质粒pEMOC2上,构建缺失tadD基因的重组自杀性质粒pEMAD。以转化了重组自杀性质粒pEMAD的大肠杆菌β2155为供体菌,APP-1型菌株S4074为受体菌进行接合转移。涂布氯霉素（Cm）抗性平皿并转印到含10%蔗糖的平皿上,筛选Cm抗性（CmR）蔗糖敏感（SurS）的接合子,进一步用PCR鉴定重组自杀性质粒已经整合到染色体中。鉴定正确的接合子在不含NaCl的培养基中培养促使第二次同源重组的发生。涂布含10%蔗糖的平皿,并转印到Cm平皿上,筛选出Cm敏感（CmS）蔗糖抗性（SurR）的克隆,用PCR和RT-PCR鉴定,以确定发生了第二次交换,重组自杀性质粒已经丢失,从而构建tadD基因缺失株。将缺失株和亲本株都进行活菌计数,绘制生长曲线,结果表明,缺失株和与亲本菌比较,生长速度没有明显的变化,说明tadD基因的缺失对S4074的生长无影响。测定亲本菌和缺失菌在Balb/C小鼠体内的毒力,计算LD50的值。结果显示,与亲本菌S4074比较,tadD基因缺失株的毒力与亲本株相比没有明显的变化。本研究还将对缺失株菌毛的形成,缺失株对宿主细胞的黏附及在宿主体内的定殖情况进行研究。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 缩略词（Abbreviation）
• 1 文献综述
• 1.1 猪传染性胸膜肺炎的概述
• 1.1.1 猪传染性胸膜肺炎的病原学
• 1.1.2 猪传染性胸膜肺炎的流行现状及危害
• 1.1.3 猪传染性胸膜肺炎的发病机制
• 1.1.4 猪传染性胸膜肺炎的临床症状和病理变化
• 1.1.5 猪传染性胸膜肺炎的诊断
• 1.1.6 猪传染性胸膜肺炎的防制
• 1.2 信号标签突变（STM）技术的研究进展
• 1.2.1 STM技术简介
• 1.2.2 STM载体介绍
• 1.2.3 STM的应用情况
• 1.2.4 STM的优点与不足
• 1.3 细菌黏附的研究进展
• 1.3.1 黏附素
• 1.3.2 受体
• 1.3.3 细菌黏附黏膜上皮细胞的过程
• 1.3.4 影响细菌黏附的因素
• 1.4 flp操纵子的研究进展
• 1.4.1 flp操纵子的发现
• 1.4.2 flp操纵子的分布
• 1.4.3 flp操纵子的进化
• 1.4.4 flp操纵子的表达调控
• 1.4.5 Tad蛋白质的功能
• 1.4.6 Flp菌毛生物发生模型
• 1.4.7 未来的研究方向
• 2 胸膜肺炎放线杆菌STM突变体库的构建
• 2.1 研究的目的和意义
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 48个质粒的扩增及保存
• 2.3.2 突变体的获取及鉴定
• 2.4 讨论
• 2.4.1 关于萘啶酸抗性菌株的获得
• 2.4.2 关于mating
• 2.4.3 关于抗生素浓度的选择
• 3 胸膜肺炎放线杆菌tadD基因结构与功能的研究
• 3.1 研究的目的和意义
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 重组自杀性质粒pEMΔD的构建
• 3.3.2 缺失株的筛选和鉴定
• 3.3.3 突变株生物学特性的研究
• 50的测定'>3.3.4 缺失菌株对小鼠的毒力试验及LD₅₀的测定
• 3.3.5 缺失菌株Flp菌毛的检测
• 3.4 讨论
• 3.4.1 负向筛选系统的选择
• 3.4.2 自杀性质粒导入APP的方法的选择
• 3.4.3 tadD基因缺失株的毒力
• 小结
• 参考文献
• 致谢
• 附录