FOXO3在红细胞分化过程的功能研究

论文摘要

红细胞分化和发育是一个极其复杂和精密的生物学过程,珠蛋白在红细胞中特异表达,并且在发育的不同时期表达不同的基因家族成员,其结构和功能异常将导致地中海贫血等遗传性血液系统疾病,因此研究珠蛋白的表达调控机制具有重要的科学理论意义和临床应用价值。本文利用高通量测序平台获得了未分化的人类胚胎干细胞（HESC）、ESC形成的拟胚体（EB）经EPO等诱导分化而成的红系母细胞（ESER）、胎肝中分离的CD34+造血干细胞经EPO等诱导分化形成的红系母细胞（FLER）和正常成人外周血中的CD34+造血干细胞分化形成的红系母细胞（PBER）的转录组（mRNA-Seq和miRNA-Seq）、全基因组DNaseI图谱（DNase-Seq）和甲基化组蛋白图谱（ChIP-Seq）等表观基因组学数据,通过系统的生物信息学分析,预测得到一些在红系分化和发育中发挥作用的重要因子,本文重点研究FOXO3在红系分化和发育中的重要作用。我们在非红系细胞293T和Hela细胞中过表达FOXO3后,发现FOXO3能够促进珠蛋白的表达,而红系特异转录调控因子GATA1和KLF1的表达水平都没有显著的提高。在人类慢性髓系白血病细胞系K562和人红系白血病细胞TF-1细胞中敲除FOXO3都能够导致ε-、γ-和p-珠蛋白表达的显著下降,但是在K562中对红系特异转录调控因子GATA1和KLFl的表达基本没有影响,而TF-1中敲除FOXO3能够引起GATA1和KLFl的表达的下降,说明FOXO3能够参与珠蛋白的表达,从而促进红系的分化。通过Ingenuity Pathways Analysis （IPA）等生物信息学分析,预测BTG1可能是FOXO3作用的目标蛋白,并通过双报告基因检测系统证明FOXO3通过与BTG1上游序列结合,从而促进BTG1的转录,进而影响珠蛋白的表达。此外,结合miRNA-Seq的数据,我们还筛选了可能抑制FOXO3表达的miRNA,并通过体外实验验证miR-200b能够作用于FOXO3的3UTR,从而抑制其表达。这些结果说明,miR-200b能够抑制FOXO3的表达,FOXO3通过激活其下游目标蛋白BTGl的转录来参与珠蛋白的表达和红系分化。斑马鱼的造血过程及造血区域与高等脊椎动物高度保守,是研究造血系统功能的最佳模式生物。通过Foxo3b MO在斑马鱼中敲除Foxo3b的表达,能够降低珠蛋白和转录因子Gatal的表达,同时还可以降低血红蛋白的含量,从而导致红细胞发育异常。这些结果与在人源细胞系K562和TF-1中的敲除FOXO3的表达相类似。综合上述实验结果,我们发现FOXO3/Foxo3b在脊椎动物的红系分化和发育中发挥着重要的作用。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• ABSTRACT
• 专业词汇中英文对照
• 目录
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1.1 红细胞分化和发育的研究
• 1.1.1 红系分化概述
• 1.1.2 转录因子在红细胞分化和发育过程中的作用
• 1.1.3 miRNA在红细胞分化和发育过程中的作用
• 1.1.4 LCR在调控红细胞的分化和发育中的作用
• 1.1.5 红细胞分化和发育异常引起的疾病及治疗
• 1.2 FOXO3的研究进展
• 1.2.1 FOXO亚族
• 1.2.2 FOXO3在红细胞分化和发育过程的作用
• 1.2.3 FOXO3的其他生物学功能
• 1.3 转录组研究在红系分化和发育中的优势
• 第二章 材料和方法
• 2.1 细胞样品
• 2.2 实验试剂和仪器
• 2.2.1 实验试剂和耗材
• 2.2.2 试剂盒
• 2.2.3 常用溶液和培养基
• 2.2.4 实验仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 基因过表达载体的构建
• 2.3.2 基因敲除载体的构建
• 2.3.3 化学转染和电转染细胞
• 2.3.4 免疫印迹技术（Western blot）
• 2.3.5 实时定量PCR（Quantitative Real-time PCR）
• 2.3.6 流式细胞仪分选细胞
• 2.3.7 FOXO3目标蛋白的检测
• 2.3.8 作用于FOXO3的miRNA的预测和检测
• 2.3.9 定点突变
• 2.3.10 细胞培养
• 2.3.11 斑马鱼的饲养、Morpholinos、原位杂交和O-邻联茴香胺染色等
• 2.4 统计学分析
• 2.5 高通量测序和分析
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 生物信息分析发现FOXO3A可能参与红系早期分化
• 3.1.1 mRNA-Seq数据分析发现FOXO3可能参与红细胞分化
• 3.1.2 DNase-Seq和ChIP-Seq数据分析发现FOXO3的基因结构在红细胞分化发育早期具有显著特点
• 3.2 FOXO3在非红系细胞中增强珠蛋白的表达
• 3.3 敲除FOXO3能够抑制红系的分化
• 3.3.1 敲除FOXO3能够抑制珠蛋白的表达
• 3.3.2 敲除FOXO3可以抑制TF-1向红系方向分化
• 3.4 FOXO3的作用目标蛋白
• 3.4.1 IPA分析FOXO3参与红系分化的调控网络
• 3.4.2 过表达或敲除FOXO3后能够影响BTG1和BCL2L1的表达
• 3.4.3 FOXO3作用于BTG1基因上游
• 3.4.4 敲除BTG1能够抑制珠蛋白的表达
• 3.5 miR-200b抑制FOXO3的表达
• 3.5.1 预测作用于FOXO3的miRNA
• 3.5.2 检测miRNA与FOXO3 3'UTR的相互作用
• 3.6 Foxo3b对斑马鱼的红系分化起着重要的作用
• 第四章 结论
• 参考文献
• 附录
• 作者简介及在学期间发表的学术论文与研究成果