小鼠CCR7重组腺病毒转染未成熟树突状细胞的实验研究

论文摘要

研究背景和目的临床上同种异体皮肤移植是目前大面积深度烧伤患者早期创面覆盖最直接、有效的治疗方法,但是由于皮肤的强烈抗原特性,导致移植后3周左右外源皮肤就会发生不可逆的排斥反应,极大抑制了自体微粒皮混合大张异体皮移植效果。如何成功诱导出皮肤移植后的免疫耐受,临床上至今未发现有效的措施。树突状细胞（dendritic cell ,DC）是目前已知的功能最强大的专职抗原提呈细胞,在免疫反应中发挥了极其重要的作用。DC的分化发育过程伴随着DC由未成熟的前体细胞分化发育为成熟细胞,细胞的形态、表面标志以及生物学功能等都发生了相应变化。作为DC未成熟的形式--- imDC（immature dendritic cell）因为其功能上最显著的特点就是可以诱导T淋巴细胞的特异性低应答而成为当前研究免疫耐受策略的热点,这在我们上一个国家自然科学基金项目（No.30271341）中也得到证实。利用imDC或者基因修饰DC进行的联合移植实验已经在肾、肝、心脏、胰腺和小肠等器官中取得了令人较为满意的效果,这为皮肤移植实验提供了非常有利的依据。DC的发育成熟过程伴随着其表型的变化,包括摄取能力减弱和MHC类分子、共刺激分子的表达上调,最终变成强大的抗原提呈细胞。研究发现imDC在炎性介质作用下逐渐迁移成熟的过程中,其表面趋化因子受体7（Chemokine receptor-7, CCR7）表达上调。通过CCR7与其配体MIP3β（即CCL19）和SLC（即CCL21）的相互作用,引导DC趋化迁移至淋巴结,由此CCR7被认为是成熟DC（mature DC,mDC）迁移归巢完成抗原递呈从而激活初始T细胞的主要受体之一。目前CCR7趋化迁移的能力在部分恶性肿瘤的转移中得到证实,表明CCR7严格调控了肿瘤细胞的转移。肿瘤细胞这种非随机的、有组织器官选择性的转移过程类似于免疫刺激过程中树突状细胞的定向迁移。基于CCR7具有非常重要的趋化迁移功能,若DC成熟度越高,CCR7表达更强,则免疫系统呈现更为强劲的免疫应答,反之则诱导免疫耐受,然而,imDC由于缺乏CCR7的表达,向淋巴结的趋化迁移特性较弱,长时间处于非T细胞区易受各种炎症因子或者外来抗原的刺激而发育为mDC,严重影响其诱导免疫耐受的效果。基于以上分析,本研究拟在国家自然科学基金的资助下,通过构建含有小鼠CCR7的重组腺病毒,尝试在imDC上建立CCR7的表达,使imDC获得原本mDC才具有的高效迁移能力,避免imDC在外周组织向成熟状态的分化,有效地确保其诱导免疫耐受功能的发挥,为临床上大面积深度烧伤患者早期创面覆盖引起的免疫排斥提供新的解决方法和思路。方法1、提取小鼠胸腺总RNA,应用逆转录PCR（RT-PCR）方法,以自行设计的带有酶切位点的引物,扩增获得CCR7基因全部序列,经过T-A克隆,酶切亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,在BJ5183菌内和pAdeasy-1同源重组,筛选阳性克隆,酶切鉴定,线性化后脂质体法转染HEK293细胞进行包装、PCR鉴定及扩增,得到含有CCR7基因的重组腺病毒,并根据报告基因GFP测定病毒滴度。2、小剂量rmGM-CSF和rmIL-4联合诱导培养BALB/c小鼠骨髓来源的imDC,光镜下观察并于第6天收获;将上述构建的重组腺病毒转染imDC,根据报告基因绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP）,检测重组腺病毒的感染效率;以空病毒为对照,应用逆转录PCR技术和免疫印迹（western blot）法,检测转染3天后imDC上CCR7基因在mRNA及蛋白水平表达的变化。结果1、成功构建了小鼠CCR7重组腺病毒载体,重组腺病毒滴度可达1×109U /ml。2、培养的imDC疏松贴壁生长,表面可见不规则的树枝状突起,体积较前增大;荧光显微镜下可见转染腺病毒的细胞膜表面染有绿色荧光,呈明显的不规则的毛刺样突起。3、重组腺病毒转染imDC后,感染效率可达70%,CCR7在mRNA及蛋白表达上与空病毒组相比明显增高。结论1、成功构建小鼠CCR7基因重组腺病毒载体。获得了高滴度的重组腺病毒。2、小鼠骨髓来源的单核细胞在应用低剂量rmGM-CSF和rmIL-4联合刺激诱导后获得具有典型形态特征的imDC。3、构建的重组腺病毒感染imDC后,CCR7的mRNA及蛋白表达明显增高,成功地在imDC上建立了CCR7的表达,并再次证明所构建的腺病毒载体方法正确,转染效率高,能够有效表达目的基因,具有较高的感染力。这为进一步研究转染CCR7的imDC的趋化迁移功能改变及其诱导皮肤移植免疫耐受提供了实验基础和依据。

论文目录

• Abstract
• 摘要
• 论文正文 小鼠CCR7 重组腺病毒转染未成熟树突状细胞的实验研究
• 前言
• 第一部分 小鼠CCR7 重组腺病毒的构建及鉴定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 重组腺病毒转染imDC 对CCR7m RNA 和蛋白表达变化的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 全文结论
• 致谢
• 照片
• 参考文献
• 文献综述 树突状细胞CCR7 功能的研究进展
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的文章